Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Otimização molecular e metabólica de Leishmania tarentolae para produção de glicoproteínas de interesse biotecnológico(Universidade Federal de Viçosa, 2022-02-24) Senra, Renato Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/1786546008789832A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido a necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros e possuem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário tripanossomátideo não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido a existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala e depender de meios de cultura de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. O Interferon-β, é uma proteína utilizada em tratamentos de doenças como esclerose múltipla, as suas glicosilações são extremamente relevantes para suas funções biológicas. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante a mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. Nesta tese foi desenvolvido e otimizado uma plataforma de expressão de glicoproteínas utilizando linhagens de L. tarentolae geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas em alta escala mais estáveis com incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica e sua aplicação na produção de Interferon-β humano. Além da validação da produção do Interferon-β, também foi realizado caracterização de seus glicanos e validação de sua atividade para regulação de inflamação em modelo murinho, demonstrando que esta nova linhagem geneticamente otimizada de L. tarentolae é adequada para produção em larga escala de glicoproteínas terapêuticas. Palavras-chave: Leishmania tarentolae. Interferon-β. Proteínas terapêuticas. GlicosilaçãoItem Desenvolvimento de uma plataforma de produção de glicoproteínas por expressão heteróloga de sialiltransferase e interferon-beta em Leishmania tarentolae(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Senra, Renato Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/1786546008789832A produção de glicoproteínas terapêuticas possui alto custo devido à necessidade de utilização de cultura de células de mamíferos que dependem de meios de cultivo complexos e caros, além de possuírem baixo rendimento de produção. Leishmania tarentolae, um protozoário não patogênico para mamíferos, tem sido sugerido como um sistema alternativo para expressão heteróloga de glicoproteínas devido à existência de métodos eficientes de expressão heteróloga, ser facilmente adaptado para produção em alta escala de baixo custo. Além disso, este protozoário apresenta modificações pós- traducionais ausentes em bactérias e leveduras, organismos mais utilizados para produção industrial de proteínas recombinantes. Entre elas, a proteína interferon-β. Esta é uma molécula glicosilada utilizada no tratamento de doenças neurodegenerativas inflamatórias e autoimunes, como a esclerose múltipla e a artrite reumatoide. Embora o perfil de glicosilação de proteínas expressas em L. tarentolae seja semelhante ao de mamíferos, existem algumas diferenças no perfil de carboidratos presentes nas terminações das cadeias glicídicas devido à ausência de enzimas de biossínteses e incorporação de ácido siálico. A presente proposta de projeto, portanto, teve como objetivo o desenvolvimento de uma plataforma de expressão de interferon-β utilizando linhagens de L. tarentolae selvagem e geneticamente otimizadas para síntese de glicoproteínas com potencial incorporação de ácido siálico na extremidade da cadeia glicídica, proporcionando uma ação mais eficaz das proteínas e reduzindo os custos de produção. As abordagens utilizadas, que visaram entender mais sobre as vias metabólicas encontradas nestes organismos utilizando dados de genômica e metabolômica, indicaram uma alternativa de tornar o sistema de expressão em L. tarentolae mais otimizado pela expressão heteróloga de sialiltransferase, enzima ausente nestes organismos. As linhagens geneticamente modificadas foram obtidas por transfecção com genes otimizados para o gênero Leishmania. A integração das sequências heterólogas de sialiltransferase e IFN-β foi confirmada por PCR e pela presença de transcritos obtidos por RT-PCR. Ensaios de eletroforese em gel de poliacriamida e marcação de proteínas com anticorpos específicos (anti-his e anti-IFN-β) também confirmaram produção heteróloga de proteína nas linhagens selecionadas.