Medicina Veterinária
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Item Interação entre Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis e as bactérias causadoras de mastite bovina, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, em linhagem de células epiteliais da glândula mamária bovina(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-15) Pena, Junnia Luísa; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/1221862960923496O estudo do agente etiológico da paratuberculose em ruminantes, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), tem ganhado expressiva importância no cenário científico nas últimas décadas. Contudo, ainda existe uma carência significativa em relação ao conhecimento do comprometimento de determinados órgãos acometidos. Dentre esses, seu papel na glândula mamária ainda é incompreendido, embora suspeita-se que MAP não tenha relação direta com a mastite, mesmo sendo eliminado no leite, a qual é a 2a via de eliminação desta bactéria. Neste estudo, foi avaliado a influência de MAP em cocultura com as principais bactérias causadoras de mastite bovina, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, em células epiteliais mamárias (MAC-T) em diferentes tempos. Foram realizados ensaios de internalização bacteriana, contagem de colônias, ensaios moleculares e avaliação da viabilidade das células MAC-Ts. Os resultados demonstraram que a presença de MAP dentro das células MAC-T, confirmada pelos ensaios moleculares de qPCR, não favoreceu a internalização de S. agalactiae, mas favoreceu a internalização de S. aureus significativamente no tempo 30 minutos. Os ensaios de viabilidade celular realizados pelo teste de MTT (brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazólio), confirmaram que durante os ensaios de internalização, as células MAC-T se apresentaram viáveis, evidenciando que o processo de internalização não foi influenciado pela morte celular e sim pela presença de MAP, S. aureus e S. agalactiae. Esses resultados confirmam a existência da interação entre MAP e os agentes clássicos causadores da mastite bovina S. aureus e S. agalactiae, favorecendo internalização de S. aureus e não influenciando a invasão de S. agalactiae durantes os ensaios de internalização bacteriana em células da glândula mamária bovina – MAC-T.Item Interação de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis com células espermáticas bovina e a correlação com proteínas de membrana do complexo 85(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-15) Albuquerque, Jéssica Lobo; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/6330644367168913A bactéria Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) é o agente responsável pela doença de Johne ou paratuberculose caracterizada por uma enterite crônica, levando à diminuição da produção, descarte de animais, desordens reprodutivas e susceptibilidade a outras doenças, principalmente em ruminantes. Possui o complexo de antígenos 85, constituída por três proteínas 85A, 85B e 85C, presentes no envelope externo, responsável por ligar-se a fibronectina da célula hospedeira. MAP consegue sobreviver às baixas temperaturas da criopreservação, no entanto pouco se sabe da sua viabilidade e sua interação com os espermatozoides, de como esta bacteria pode alterar a viabilidade do material genético antes e pós- congelamento. Assim, este estudo propôs determinar características do espermatozoide bovino na presença de MAP e sua viabilidade pós congelamento bem como estudar esta interação. Foi utilizado um bovino apto para a reprodução para coleta de sêmen e foi inoculado concentrações de baixa e alta carga bacteriana de MAP, avaliando-se quanto a motilidade e vigor, potencial da atividade mitocondrial antes e pós congelamento, e interação de MAP com as células espermáticas através de microscopia de varredura. Além disso foi avaliado a viabilidade de diferentes concentrações de MAP pós congelamento. Foram produzidos anticorpos a partir de proteínas do complexo 85 de MAP (85A e 85B) e utilizados nestas análises. Foi possível determinar a viabilidade de MAP após a criopreservação em amostras de concentrações maiores, o que demonstra o potencial de transmissão deste patógeno através da inseminação artificial (IA). Observou-se que o sêmen bovino na presença de MAP apresenta diminuição na motilidade e vigor proporcional a concentração de MAP e que proteínas de membrana de MAP, 85A e 85B, podem estar relacionados a interação/adesão com as células espermáticas, que ocorre na cauda do espermatozoide principalmente na peça intermediaria.Item Mastite caprina: aspectos epidemiológicos e moleculares das infecções persistentes por Staphylococcus aureus e Escherichia coli(Universidade Federal de Viçosa, 2018-01-25) Lima, Magna Corôa; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/7772319805213157A mastite é uma enfermide de grande importância nos ruminantes, principalmente nos animais com aptidão leiteira, causando prejuízos econômicos diretos e indiretos além de riscos à saúde dos consumidores de leite e derivados, pois esses alimentos podem veicular microrganismos patogênicos e/ou toxinas. Este estudo objetivou revisar quanto aos tratamentos para mastite caprina, identificar e caracterizar as bacterias isoladas de leite de cabras com diferentes mastites, determinar o perfil das propriedades e os fatores de risco para mastite, identificar alterações da infecção intramamária persistente por Staphylococcus aureus após o tratamento com enrofloxacina e avaliar a diversidade de Esherichia coli isolados de cabras leiteiras com mastite clínica, subclínica e persistente. Um total de 539 cabras em lactação foram examinados e 268 amostras individuais de leite (uma/teto) foram coletadas de animais positivos no teste da caneca de fundo escuro e/ou Califórnia Mastitis teste (CMT). A prevalência de mastite subclínica foi de 28,0% e da clínica, 2,8%. A multiplicação bacteriana foi obtida em 62,0% das amostras. Um total de cento e oitenta e sete bactérias foram identificadas (fenotípica e genotípica). As espécies mais isoladas foram S. aureus (60,4%), Staphylococcus epidermidis (9.1%,), Escherichia coli (6.9%), Staphylococcus saprophyticus (5.9%) e Staphylococcus caprae (4,3%). No gênero Staphylococcus predominou perfil de resistência à classe de beta-lactâmicos: penicilina, ampicilina e oxacilina, além da tetraciclina. Doze por cento dos isolados apresentaram resistência múltipla a antimicrobianos (MDR). Entre as bactérias com maior prevalência de MDR, 38,5% E. coli e 10,6% S. aureus. Os produtores são tecnificados, trabalham com raças leiteiras especializadas e possuem bom manejo. Os fatores de risco: ordenha manual, utilização de cama, baixa frequencia de limpeza dos bebedouros, intervalo entre partos menor de 12 meses. S. aureus isolado de mastite persistente após o tratamento com enrofloxacina foi encontrado somente um complexo clonal, (133) e apresentaram pulsotipos idênticos ou estreitamente relacionados, confirmando a persistencia. Nos isolados após o tratamento com enrofloxacina aumentaram a concentração inibitória mínima para enrofloxacina, ampicilina e gentamicina. Houve pouca variação na presença dos genes de resistência, entretanto para genes de sistema de efluxo multidrogas variaram consideravelmente. A presença do gene norA aumentou em 50% nos isolados obtidos após o tratamento. A resistência antimicrobiana é o fator predominante na persistência mastite caprina. Foram encontrados 15 E. coli, sendo: nove (60,0 %) de mastite subclínica, quatro (26,7 %) de clínica e dois (13,3 %) de persistente. Houve maior número de isolados apresentando resistência frente a cefatiofur, tetraciclina e cefalexina e o índice de resistência multipla ocorreu em 33,3 %, variando de 0,2 a 0, 5. E. coli obtidos de animais com mastite clínica, a CIM foi maior para tetraciclina, ampicilina e gentamicina, os obtidos de mastite persistente apresentaram valores maiores da MIC frente a tetraciclina, ampicilina, cefoperazona e ciprofloxacina, e os isolados de animais com mastite subclínica observou-se maiores MIC para tetraciclina e cefoperazona. No perfil clonal não houve associação entre o cluster e o tipo de mastite. E. coli isolados de cabras com mastite persistente possui maior capacidade de adesão e invadem as células epiteliais mamária bovina (MAC-T). São necessários mais estudos para validar a eficácia e segurança dos antimicrobianos para tratamento da mastite caprina. As propriedades da Zona da Mata de Minas Gerais os Produtores são bem instruidos e tecnificados, criam raças especializadas na produção de leite, e não possuem assistência veterinária. Staphylococcus aureus foi a bactéria mais isolada com perfil de resistência principalmente aos beta-lactâmicos. Esherichia coli foi a bacteria Gram negativa mais prevalente. Foram observadas alterações nos perfis de resistência nos isolados de S. aureus obtidos após o tratamento com enrofloxacina. Não há uma relação entre os perfis estudados de E. coli e o tipo de mastite, entretanto E. coli isolados de cabras com mastite persistente apresentou maior capacidade de adesão e invasão.Item Avaliação do potencial antimicrobiano da 2,2’,4-triidroxi- benzofenona sobre bactérias patogênicas de aves(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-15) Realpe Aranda, Martha Isabel; Moreira, Maria Aparecida ScatamburloNa avicultura, a disseminação de patógenos bacterianos e a ocorrência de surtos, determinam elevados prejuízos econômicos. Muitas destas bactérias são zoonóticas, causando grande preocupação em termos de saúde pública. Os agentes antimicrobianos são importantes para a prevenção e tratamento destas infecções. No entanto, o uso indiscriminado destas moléculas proporciona condições favoráveis para a seleção, propagação e persistência de bactérias resistentes. Na procura de novas moléculas antimicrobianas, as benzofenonas vêm despertando grande interesse, no entanto, a atividade antibacteriana nunca foi pesquisada anteriormente no composto sintético 2,2’,4-triidroxibenzofenona. Este trabalho, objetivou-se avaliar o potencial antimicrobiano de 2,2’,4- triidroxibenzofenona em agentes etiológicos de doenças importantes, verificar o efeito citotóxico, o efeito sinérgico com antimicrobianos convencionais, além de analisar o sitio de ação. Os resultados sugerem que a benzofenona possui atividade antimicrobiana para as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas testadas e não induz efeitos tóxico nas células animais. Observou-se que a benzofenona atua sobre a parede bacterina. E encontrou-se efeito sinérgico com a bacitracina. A benzofenona é uma candidata promissora a ser usada no tratamento das bacterioses avícolas.Item Molecular evolution and retrospective detection of Porcine circovirus 3 in pig production(Universidade Federal de Viçosa, 2018-06-21) Saraiva, Giuliana Loreto; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://lattes.cnpq.br/4694803031957630The pork industry has increased significantly over the last decades due to the increased consumption of this source of animal protein. The pressure for better efficiency and production has led to an increased production and intensification of international trade and genetic resources. Concurrently with the growth of the pork industry, the diseases present in pig farming have never been so diversified and the number of reports of emerging pathogens has increased significantly over the past 30 years. Considering this information, the present study aimed to conduct a retrospective study of detection and analyze the molecular evolution of an emerging virus in the pork industry, the Porcine circovirus 3 (PCV3). For the retrospective study of PCV3 detection in Brazil, laboratory-stored DNA samples were used for the detection of the virus by the conventional PCR technique. After sequencing the positive samples, phylogenetic and molecular analyzes were performed to understand the epidemiology of PCV3 in Brazil. In addition, phylogenetic analyzes and comparative genomics were conducted to find a possible evolutionary origin of PCV3. The results of this study provided important information about PCV3, which would serve as a basis for the development of control and prevention measures.Item Fatores de risco associados à transmissão da cisticercose bovina em propriedades rurais rastreadas a partir de estabelecimento de abate(Universidade Federal de Viçosa, 2018-05-25) Duarte, Camilla Taveira Ducas; Pinto, Paulo Sérgio de Arruda; http://lattes.cnpq.br/9392334092675008A cisticercose bovina é uma enfermidade de distribuição cosmopolita e de caráter zoonótico, causada pela forma larval Taenia saginata. A prevalência dessa zoonose em estabelecimentos de abate é responsável por consideráveis perdas econômicas para o país devido à condenação e ao aumento do custo de processamento das carcaças submetidas a aproveitamento condicional de bovinos infectados. Apesar da importância da cisticercose bovina para a saúde pública, para a saúde animal e para economia, a realidade epidemiológica da ocorrência dessa zoonose no Brasil é pouco conhecida. Dessa forma, esta pesquisa teve por objetivo realizar um levantamento epidemiológico e avaliar os principais fatores de risco relacionados com a transmissão da cisticercose bovina em animais enviados para abate provenientes de propriedades localizadas na região do Triângulo Mineiro, com base no rastreamento dos casos de cisticercose bovina detectados em um estabelecimento de abate do município de Uberlândia-MG. Foi realizado um estudo de corte transversal em 87 propriedades. A partir da Guia de Trânsito Animal (GTA) foram obtidos os endereços das propriedades incluídas no estudo e realizadas as coletas de sangue de 1024 bovinos. O diagnóstico sorológico realizado por triagem pelo teste Elisa indireto e Immunoblot para confirmação. Foi aplicado também um questionário epidemiológico sobre as condições sanitárias das propriedades, em relação ao sistema de criação animal, como por exemplo, manejo, origem dos animais, atividade predominante, fonte de abastecimento de água, higiene pessoal, padrão de alimentação e moradia das propriedades, a fim de determinar os possíveis fatores de risco associados a transmissão T. saginata. A prevalência encontrada foi de 5,1% (IC 95%= 3,74-6,42). Os fatores de risco identificados na área de estudo foram a origem dos bovinos (RC= 4,9 IC 95%= 1,5 – 15,8), sistema de pastejo (RC= 6,4 IC 95%= 2,0-20,2) e destino do esgoto das propriedades (RC= 3,6 IC 95%= 2,3-5,6). A partir da análise espacial foi identificado um aglomerado na região de estudo, com risco de infecção 2,85 vezes maior nas propriedades localizados dentro desse aglomerado quando comparado com as propriedades localizadas fora dessa área. Esses resultados mostram que a região do Triângulo mineiro é endêmica para a doença e medidas preventivas devem ser aplicadas em relação ao sistema de manejo e a estrutura infra sanitária das propriedades.Item Detecção molecular de hemoparasitos em cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa - Viçosa/MG(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Ortega Orozco, Andrés Mauricio; Vilória, Marlene Isabel Vargas; http://lattes.cnpq.br/7880463253102582Neste estudo foram analisadas 100 amostras de sangue de cães, com trombocitopenia marcada (plaquetas < 100.000/μL) ou com visualização direta de hemoparasitas (ou inclusões compatíveis) no esfregaço sanguíneo, obtidas da rotina do laboratório de análises clínicas do DVT (Departamento de Veterinária), do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa (UFV). As amostras foram submetidas à extração de DNA e posteriormente à reação em cadeia da polimerase de tipo nested (nPCR), para o diagnóstico molecular de A. phagocytophilum e outros hemoparasitas. Do total das amostras, 60 foram positivas para no mínimo um hemoparasita. Foi possível detectar a presença de quatro gêneros de hemoparasitas nas amostras de sangue avaliadas: Ehrlichia, Anaplasma, Babesia e Hepatozoon. Foram amplificadas um total de 26 produtos do primer Ehrlichia spp monocítica, 23 de Ehrlichia spp granulocítica 26 com BAB-rum e 10 utilizando o hsp70. Logo ao analisar os resultados, de um total de 86 amostras foi possível identificar os seguintes hemoparasitas: 23 E. canis (identidade 94%-100%), 7 A. platys (identidade 97%-100%), 11 B. vogeli (identidade 86%-99%) e 15 H. canis (identidade 94%-99%). Nenhuma amostra foi positiva utilizando o primer msp4, específico de A. phagocytophilum, porém, o sequenciamento de uma das amostras amplificadas teve uma identidade de 99% com um fragmento da sequência parcial do gene 16S rRNA de A. phagocytophilum depositada no GenBank. A não amplificação de produtos com um primer específico para A. phagocytophilum pode ser atribuída a diversas hipóteses, mas isto não exclui a possibilidade que a bactéria esteja presente no município de Viçosa ou da microrregião.Item Validação da técnica de PCR em tempo real (qPCR) para detecção de Mycobacterium bovis e Brucella abortus em amostras de leite cru(Universidade Federal de Viçosa, 2017-03-10) Mascarenhas, Débora Rocha; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/8414815634294191Mycobacterium bovis e Brucella abortus são os agentes etiológicos da tuberculose e da brucelose bovinas, doenças infectocontagiosas de ocorrência mundial que geram grandes prejuízos econômicos e podem ser transmitidas aos humanos principalmente através do contato direto com animais contaminados e da ingestão de leite cru e derivados. No Brasil existe o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose, criado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que estabelece a realização do diagnóstico e normatiza as medidas de controle dessas zoonoses. Os métodos oficiais para diagnóstico de brucelose e tuberculose no animal vivo possuem sensibilidade e especificidade variáveis, são laboriosos e demandam tempo. Para aumentar a eficácia do controle destas doenças são necessários métodos rápidos e acurados, que atuem como ferramenta auxiliar no diagnóstico in vivo dessas enfermidades sem a necessidade de procedimentos invasivos. Para garantir a credibilidade e confiabilidade de novos métodos de diagnóstico é necessário que os mesmos sejam validados. No presente estudo foram realizados ensaios para a validação de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para a detecção do DNA de M. bovis e B. abortus em amostras de leite cru artificialmente contaminados, usando como critério o desempenho analítico (sensibilidade e especificidade analítica), repetibilidade, reprodutibilidade interna e robustez. Inicialmente cinco metodologias de extração de DNA foram testadas e as que apresentaram melhores resultados foram os kits comerciais DNeasy mericon Food Kit – Qiagen e Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega. Os limites de detecção obtidos na qPCR validada nesse estudo foram de 2,3 pg de DNA de M. bovis e 20,7 fg de DNA de B. abortus. As repetibilidades eviii reprodutibilidades aliadas à robustez apresentadas nesse trabalho indicam que os métodos avaliados podem ser utilizados de forma auxiliar ao diagnóstico in vivo oficial de tuberculose e brucelose bovinas, após ser testada em animais naturalmente infectados.Item Potencial antimicrobiano de substâncias extraídas do fruto de Garcinia brasiliensis sobre isolados de Streptococcus spp. obtidos de mastite(Universidade Federal de Viçosa, 2016-08-01) Maia, Natasha Lagos; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/6095018183149140A mastite bovina é uma enfermidade de grande ocorrência em rebanhos leiteiros de todo o mundo, constituindo assim, um cenário preocupante, devido aos impactos na saúde pública e também na economia dos países, principalmente o Brasil, pois é um dos maiores produtores de leite. Concomitantemente à ocorrência da mastite, é crescente o número de isolados bacterianos causadores desta doença que têm apresentado resistência antimicrobiana às mais diversas substâncias farmacológicas, principalmente, devido à utilização indiscriminada destas drogas. A investigação de novas moléculas com potencial antimicrobiano, assim como o uso de associações com as drogas tradicionais, tornou-se de grande necessidade. Este trabalho teve como objetivo, investigar a ação antimicrobiana de duas substâncias bioativas, a gutiferona-A (M11) e 7- epiclusianona (M6), sobre isolados de campo, Streptococcus uberis (Su959) e Streptococcus agalactiae (Sa4605) obtidos de leite de animais com mastite. Realizaram-se testes para definição da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antimicrobianos sintéticos e das substâncias bioativas, as quais variaram a de 0,6 a 125 μg/mL. Foi confirmado o potencial antimicrobiano destes últimos, além da ineficácia da ampicilina e gentamicina no controle da multiplicação de ambos os isolados. Após esta constatação, foi investigada a presença de interações sinérgicas, utilizando o método Checkerboard a partir de combinações de M11 e M6 com ampicilina e gentamicina. Dentre oito associações determinadas, seis apresentaram interação sinérgica positiva, evidenciando a recuperação e potencialização da ação dos antimicrobianos sintéticos frente aos isolados bacterianos estudados, antes resistentes à ação individual dos mesmos. Usando a metodologia do teste do MTT ((3-[-4,5- dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolium brometo), avaliou-se a viabilidade celular quando da exposição individual de cada antimicrobiano (sintético e bioativo), a fim de conhecer o caráter citotóxico destas sobre as células MAC-T (células epiteliais da glândula mamaria de bovinos). O resultado obtido mostrou que somente a M11 foi citotóxica nas concentrações 2xCIM e 1xCIM determinada previamente na presença de Su959 e 2xCIM determinada previamente na presença de Sa4605. Porém, as concentrações necessárias para potenciar ação dos antimicrobianos sintéticos são doses iguais ou abaixo de 0,5xCIM, não indicadas como tóxicas no teste in vitro. Assim, pode-se afirmar que a gutiferona- A e 7-epiclusianona apresentaram eficaz ação antimicrobiana individual sobre os isolados de campo de Streptococcus uberis e Streptococcus agalactiae, além de se mostrarem promissoras candidatas para serem utilizadas em associações com os antimicrobianos sintéticos ampicilina e gentamicina, a fim de recuperar e otimizar a ação antimicrobiana dos mesmos.Item Studies on the interaction between Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and bovine mastitis associated Escherichia coli in a mammary epithelial cell model and identification of passive shedding in small ruminants(Universidade Federal de Viçosa, 2016-12-09) Schwarz, David Germano Gonçalves; Moreira, Maria Aparecida Scatamburlo; http://lattes.cnpq.br/7355939637494318Mastitis caused by Escherichia coli can intensely stimulate the immune system and rapidly trigger inflammation in the mammary gland. In contrast, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), the etiological agent of paratuberculosis, characterized by chronic granulomatous enteritis, can infect the mammary gland without intensely stimulating the inflammatory response. The interaction of these two species in the mammary gland is still unknown. In some cases, both the elimination of MAP by milk and faeces may occur passively, either through ascending infection of the mammary gland or through ingestion of MAP, respectively. These animals are called passive- shedders and are important as a source of infection to susceptible animals in the herd. The aim of this study was to investigate the relationship between MAP and E. coli in mammary gland cells under experimental conditions and verify the presence of passive- shedder animals. The relationship between a K-10 strain of MAP and E. coli isolated from mastitic milk in mammary epithelial cell lines was evaluated. Cells previously infected by MAP decreased E. coli invasiveness during 120min experimentation. However, the efficiency of E. coli translocation was not compromised, nor was the viability of the MAC-T cells. In contrast, cells previously infected by E. coli showed increased basal-apical translocation capacity of MAP up to 30 min and decreased at 120 min postinfection. Quantification of cytokines showed that IL-1β expression at 120 min was significantly increased in cells infected by MAP + E. coli and E. coli only. Expression of MAPKp 38 and IL-10 were not significant, regardless of time postinfection. To determine the occurrence of passive-shedders, 10 properties were previously investigated for MAP detection. Thirteen goats were positive by faeces culture and/or milk PCR. Among the positive animals, four (4/13) were evaluated by IS900-PCR, feces culture, milk and tissue culture and serology (ELISA). All the results were negative over a one-year period, demonstrating that the animals performed pass- through phenomenon and upward contamination of the mammary gland without becoming infected. Together, these results indicate that the presence of MAP in mammary cells may hamper capacity of E. coli invasion, but when within the mammary cell, the bacteria evade more efficiently. However, when the cells are pre-infected by E. coli, MAP is rapidly attracted from the subepithelial region to the cell surface. IL-1β production enhances the attraction of macrophages to the site of infection, where MAP benefits by infecting them.