Bioquímica Agrícola
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Item Mastite bovina: avaliação de antígenos de Staphylococcus aureus para diagnóstico e o papel do regulador LysR na interação patógeno-hospedeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-19) Klein, Mary Hellen Fabres; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/7789291493996522Infecções intramamárias causadas por Staphylococcus aureus são em sua maioria de natureza subclínica e evoluem frequentemente para persistente. O diagnóstico preciso dos animais infectados é fundamental para evitar a dissiminação do patógeno e prevenir o surgimento de novas infecções. A cultura bacteriológica é utilizada como padrão-ouro na identificação de patógenos causadores de mastite, mas a demora na obtenção de resultados ainda é um grande entrave. Os imunoensaios são uma abordagem alternativa para o diagnóstico que podem ser rápidos, específicos e, em alguns casos, realizados em campo. Na busca por marcadores para o diagnóstico da mastite bovina causada por S. aureus, avaliou- se a capacidade de três proteínas na identificação da bactéria em amostras de leite mastítico. O potencial de IsaA e Nuc para o immunodiagnóstico de S. aureus de origem bovina foi mostrado, embora seja necessária a padronização do método para que a sensibilidade aumente. Sugere-se que apenas uma região da proteína seja usada no teste. Neste trabalho, o papel de um regulador transcricional putativo da família LysR (SAB2209) também foi avaliado para expandir nosso conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na patogênese de S. aureus. A superexpressão de LysR afetou a formação de biofilme e a susceptibilidade a estresse oxidativo, no entanto sem afetar o crescimento bacteriano e hemólise. LysR também reduziu a colonização da bactéria em ensaios ex vivo e in vivo. Análise do transcriptoma mostrou que 34,8% dos genes de S. aureus RF122 foram alterados em resposta à superexpressão de SAB2209. O gene sortase A (srtA), que codifica uma transpeptidase que ancora adesinas na parede da célula, e os genes tagX e tagB, envolvidos na produção de ácido teicóico foram reduzidos 3,0; 7,3 e 11,2 vezes, respectivamente. Em contraste, a transcrição dos genes responsáveis pela biossíntese de purinas e adenosina sintase (adsA) foi estimulada. Os nossos resultados sugerem que SAB2209 influencia passos iniciais para a colonização de S. aureus e evasão do sistema imune do hospedeiro, através da alteração da expressão de genes associados com a função da parede celular e estratégias evasivas.Item Caracterização química, nutricional e potencial antioxidante da polpa dos frutos de Euterpe edulis Martius e sua avaliação nos fatores de risco e nas lesões ateroscleróticas em camundongos apoE -/-(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-30) Cardoso, Luciana Marques; Leite, João Paulo Viana; http://lattes.cnpq.br/7846855075166389A espécie Euterpe edulis Martius, da família Arecaceae, popularmente chamada de palmeira juçara e pertencente ao mesmo gênero botânico do açaizeiro da Amazônia (Euterpe oleracea Martius) produz frutos de coloração roxa intensa, devido, principalmente, à presença de antocianinas. As antocianinas possuem propriedades antioxidantes e antiinflamatórias e há evidências que podem contribuir para a redução da progressão de lesões ateroscleróticas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a composição química, nutricional e o potencial antioxidante da polpa liofilizada dos frutos de E. edulis (PLFE) e avaliar seu efeito nos fatores de risco e nas -/- lesões ateroscleróticas em camundongos ApoE . Foi encontrado por HPLC- DAD e HPLC-ESI-MS a presença de seis antocianinas, sendo a cianidina 3- rutinosideo (440 mg/100g) e a cianidina 3-glicosideo (147 mg/100g) as predominantes. Na PLFE também foi identificado outros compostos como polifenóis, flavonóides, saponinas, β -caroteno e minerais, como o Ca, P, Na, K, Mg, Zn, Fe, Cu e Mg. A composição centesimal da PLFE apresentou 6,98% de proteína, 41,4% de lipídios e 42,17% de carboidratos, sendo que destes 71,89% e 10,85% é representado por fibra insolúvel e fibra solúvel, respectivamente. Com relação ao perfil lipídico da PLFE, foi identificado um alto conteúdo de ácidos graxos insaturados (72,93%), sendo que destes 33,02% e 39,91% foram constituído de ácidos graxos monoinsaturados e poliinsaturados, respectivamente. A PLFE apresentou atividade antioxidante, mensurada por DPPH, sendo o valor de EC50 de 81,7 ppm. Os tratamentos com a PLFE foram também comparados com o acetato de α-tocoferol e ambos reduziram fatores de risco associados a aterosclerose. Os resultados in vivo sugeriram atividade antioxidante da PLFE, acarretando na diminuição significativa da atividade da catalase em todos os tratamentos com a PLFE (doses de 2, 6 e 10%) e no grupo que recebeu acetato de α-tocoferol (G6), em relação ao controle positivo (G2). A atividade da superóxido dismutase e os níveis de triglicerídeos plasmáticos foram reduzidos no G4, que recebeu a dose de 6% de PLFE na dieta. Uma atividade antiinflamatória da PLFE na dose de 10% pode ser destacada, através da redução de infiltrados inflamatórios, das gotículas de lipídeos e de colágeno no fígado dos camundongos apoE -/- , componentes estes associados a processos inflamatórios como a esteatose e a fibrose hepática. Nossos resultados sugerem que compostos presentes na PLFE, como as antocianinas, fibras, ácidos graxos insaturados, vitaminas e minerais, podem contribuir para reduzir fatores de risco associados à aterosclerose.Item Obtenção de uma linhagem de soja sem inibidor de tripsina Kunitz e lectina e sua avaliação bioquímico-nutricional(Universidade Federal de Viçosa, 2005-03-28) Salla, MARIA Fernanda Spegiorin; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://lattes.cnpq.br/6490966175710971O presente trabalho está inserido no Programa de Melhoramento da Qualidade e do Sabor da Soja do Bioagro/UFV e tem como objetivo principal a obtenção e caracterização bioquímico-nutricional de uma linhagem de soja com sementes livres de KTI (inibidor de tripsina Kunitz) e lectina. Foram construídos primers específicos para identificar os alelos recessivos dos genes que codificam KTI e lectina. Após a obtenção de uma linhagem contendo elevado teor de proteína e ausência de KTI e lectina, a eficiência de recuperação das características do genitor recorrente com elevado teor protéico foi avaliada. Para isso, utilizou-se a técnica de RAPD para o cálculo da distância genética entre os genótipos doadores do elevado teor de proteína (Monarca HyPro), ausência de KTI (BRM925297), ausência de lectina (Columbia) e a linhagem obtida. A similaridade genética média entre a linhagem final e a isolinha Monarca HyPro foi de 98%. Este resultado revelou um bom índice de recuperação do genoma do recorrente. Os valores de atividade de inibição de tripsina nos genótipos com presença e ausência de KTI foram, respectivamente, 390,33 e 134,40 mg de tripsina inibida/g de proteína, diferindo estatisticamente entre si. A composição química centesimal da isolinha com ausência de KTI e lectina mostrou-se de acordo com a literatura. A avaliação da qualidade protéica das sementes de soja livres de KTI e lectina foi conduzida por meio de ensaios biológicos com ratos Wistar, durante 14 dias. Os índices avaliados foram digestibilidade verdadeira, PER (coeficiente de eficiência protéica), NPR (razão protéica líquida) e NPU (utilização protéica líquida). Os ratos alimentados com a soja livre de KTI e lectina mostraram uma melhor digestibilidade em relação à variedade comercial, com valores próximos aos da caseína, considerada uma proteína padrão. A integridade das microvilosidades do epitélio intestinal de ratos alimentados com dietas à base de soja convencional ou soja livre de KTI e lectina foi avaliada. Os animais alimentados com soja convencional apresentaram um maior nível de alterações na morfologia das microvilosidades intestinais, quando comparados àqueles alimentados com a soja livre de KTI e lectina. Concluiu-se que a retirada genética do KTI e da lectina melhorou significativamente a digestibilidade das proteínas da soja, eliminando a necessidade de se empregar elevadas temperaturas no processamento da soja.Item Purificação e atividade antibacteriana de peptídios sintetizados durante a germinação de sementes de soja (Glycine Max [L.] Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-30) Barbosa, Meire de Oliveira; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://lattes.cnpq.br/3245761154557285Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse.Item Correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva em sementes de soja(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-30) Valente, Maria Anete Santana; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7809094025770798O dobramento de proteínas secretórias no lúmen do retículo endoplasmático é altamente facilitado por chaperones moleculares. A proteína BiP é um dos chaperones mais bem caracterizados residentes do RE. BiP tem demonstrado ser um modulador multifuncional de vários processos que ocorrem no retículo endoplasmático. Essa proteína auxilia no dobramento e enovelamento das cadeias polipeptídicas nascentes e exerce papel no controle de qualidade do RE, reconhecendo e direcionando proteínas incorretamente dobradas para degradação. Também funciona como um sensor da via de resposta a proteínas incorretamente enovelada (UPR), regulando indiretamente a atividade da cinase eIF-2 e a sua própria expressão. As proteínas de reserva são sintetizadas em ribossomos associados à membrana do retículo endoplasmático, sendo co-traducionalmente translocadas para o lúmen do RE, onde podem permanecer associadas em corpos protéicos ou ser transportadas, via complexo de Golgi, para vacúolos de proteínas de reserva. Evidências na literatura indicam que BiP associa-se com proteínas de reserva in vitro, e seu acúmulo nas sementes está coordenado com a síntese de proteínas de reserva. Nesta investigação, foram analisados o nível de BiP nos diferentes estádios de desenvolvimento de sementes de soja e a correlação entre as concentrações de BiP e de proteínas de reserva de sementes. Para isso, utilizaram-se sementes de soja das variedades CAC-1 e CC3 com diferentes teores de proteína, determinados pelo método Kjeldahl. BiP acumulou-se predominantemente nos estádios iniciais de desenvolvimento das sementes, coincidindo com a síntese ativa de proteínas de reserva. O acúmulo temporal de BiP foi significativamente superior nas sementes CC3 que apresentam maior teor protéico. A capacidade de BiP associar-se a proteínas de reserva foi funcionalmente avaliada por meio do sistema duplo híbrido. Este ensaio demonstrou que BiP interage eficientemente com a subunidade de - conglicinina em leveduras. A partir desses resultados, surgiu a hipótese de que um aumento da expressão de BiP poderia resultar em elevação do teor de proteína das sementes. O efeito da superexpressão da proteína BiP no teor de proteína total foi diretamente avaliado em sementes de Nicotiana tabacum transgênicas (geração T4) superexpressando o gene BiP da soja. Embora o nível de BiP nas sementes transgênicas, detectado por immunoblotting e quantificado por densitometria, tenha sido maior nas linhagens transgênicas senso em relação às controle e anti-senso, a superprodução constitutiva de BiP não foi correlacionada diretamente com o aumento do teor protéico, determinado pelo método Kjeldahl. Esses resultados sugerem que a capacidade de processamento do retículo endoplasmático em tabaco durante o desenvolvimento da semente não constitui o fator limitante do processo de síntese e acúmulo de proteínas de reserva.Item Resposta bioquímica da lagarta da soja ao inibidor de protease benzamidina e seus efeitos no desenvolvimento pós-embrionário(Universidade Federal de Viçosa, 2004-02-11) Pilon, Anderson Martins; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/3029855503851279Dos seres vivos existentes, 72% são insetos, sendo que 50% destes são fitófagos. Na coevolução entre plantas e insetos, as plantas desenvolveram mecanismos de defesa contra o ataque de insetos. Dentre estes mecanismos destaca-se a produção de inibidores de protease. É postulado que, quando uma planta é atacada ou ferida, ela propicia um aumento nos níveis de inibidores de proteases na região ferida (resposta local) e ou por toda a planta (resposta sistêmica). Nesta interação inseto-planta, os insetos podem desenvolver mecanismos de defesa contra os inibidores de proteases produzidos pela planta. Esta possibilidade demanda um conhecimento mais elaborado do comportamento das enzimas proteolíticas do intestino médio dos insetos, a partir da ingestão crônica de inibidores de protease no momento do ataque à planta. Plantas de soja atacadas por larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) induzem, através da via das lipoxigenases, o aumento na síntese de inibidores de proteases, como uma forma de defesa ao ataque do inseto (FORTUNATO, 2001). Este inseto apresenta proteases tripsinas-like como enzimas digestivas (XAVIER, 2002). Tomando conhecimento destas informações e por ser a soja uma importante cultura para a economia brasileira, buscamos realizar a caracterização bioquímica e fisiológica do efeito do inibidor de tripsina benzamidina na digestibilidade protéica, crescimento e desenvolvimento de Anticarsia gemmatalis. Neste sentido, o presente trabalho baseou-se na determinação da digestibilidade e os efeitos no crescimento e desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, assim como a avaliação da atividade das proteases digestivas presentes no intestino médio da lagarta, quando alimentadas com o inibidor de tripsina benzamidina nas concentrações 0; 0,25; 0,50 e 0,75 (% p/p de dieta artificial). Verificamos, através do teste de Tukey (p < 0,05), que a adição de benzamidina alterou significativamente a digestibilidade do alimento proteico. Tal alteração está correlacionada com impactos negativos ocasionados na fase larval desse inseto, tais como aumento do ciclo larval, diminuição de ganho de peso e aumento da mortalidade. Verificamos que tanto a atividade proteolítica quanto a atividade amidásica apresentaram maiores índices em lagartas de 5o instar. Observamos também que a presença do inibidor alterou os perfis de atividades, sugerindo que os insetos, após a ingestão alta de inibidores de proteases, podem apresentar respostas de defesa através da hiperprodução de proteases sensíveis à benzamidina e/ou síntese de proteases insensíveis ao inibidor. Portanto, estes dados sugerem que a utilização de inibidores de protease possa ser uma estratégia promissora no controle de Anticarsia gemmatalis na cultura da soja.Item Efeitos de alendronato de sódio, atorvastatina cálcica e ipriflavona, isoladamente e em associação, na osteoporose induzida com dexametasona(Universidade Federal de Viçosa, 2004-09-14) Pinto, Aloísio da Silva; Oliveira, Tânia Toledo de; http://lattes.cnpq.br/9748207181000775Este trabalho consistiu de dois ensaios biológicos com o objetivo de estudar as influências do bifosfonato alendronato de sódio, da estatina atorvastatina cálcica e do flavonóide ipriflavona, isoladamente e em associação, na osteoporose induzida pelo glicocorticóide dexametasona, em ratas da raça Wistar, adultas, pesando 250 ± 20g. O processo da indução da osteoporose consistiu na administração de dexametasona, na dose de 7 mg/kg de peso corporal, por via IM, uma vez por semana, durante cinco semanas, nos seis animais de todos os grupos, à exceção dos animais que constituiu o grupo controle (G1), que receberam, via IM, solução de NaCl à 0,9%. Os animais do grupo 2 (G2), chamado osteoporótico, receberam apenas dexametasona; Após a indução, iniciou-se os tratamentos. No primeiro ensaio, o grupo 3 (G3) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio na dose de 0,2 mg/kg; grupo 4 (G4) que recebeu dexametasona mais atorvastatina cálcica na dose de 1,2 mg/kg e grupo 5 (G5) que recebeu dexametasona mais ipriflavona na dose de 100 mg/kg. No segundo ensaio, procedeu as combinações das respectivas substâncias, sendo: (G3) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio a 0,1 mg/kg + atorvastatina cálcica a 0,6 mg/kg; (G4) que recebeu dexametasona mais alendronato de sódio a 0,1 mg/kg + ipriflavona a 50 mg/kg e (G5) que recebeu dexametasona mais atorvastatina cálcica a 0,6 mg/kg + iprilfavona a 50 mg/kg. Todas as substâncias foram administradas por via oral, diariamente. Nos períodos de 7, 14, 21 e 28 dias, após o início dos tratamentos, foram coletados amostras de sangue para dosagens de cálcio e fósforo no equipamento multiparamétrico de bioquímica Alizé com “kits” da marca BioMerieux, e fosfatase alcalina óssea no equipamento de quimioluminescência Access Immunoassay System da Beckman Coulter com “kits” Ostase. Após o sacrifício, foi coletado fêmur direito de cada animal que, uma vez processado rotineiramente e obtido as lâminas, cujos cortes foram corados com hematoxilina e eosina, foi estudado histologicamente em microscopia de luz. Procedeu-se o cálculo percentual da densidade trabecular óssea, à partir da imagem amostral de osso trabecular, contida na região subcondral, de cada corte histológico, em microscópio óptico equipado com câmara digital (TCL-984 P), analisada em monitor de microcomputador de 14 polegadas, utilizando-se da técnica de histomorfometria de contagem de pontos. Os ensaios biológicos foram realizados segundo delineamento inteiramente casualizado, com cinco tratamentos em seis repetições. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e ao teste F (p<0,05). Os grupos controles (G1 e G2) foram comparados entre si, por meio do teste F. Os grupos tratados (G3, G4 e G5) foram comparados entre si, através do teste de Tukey à 5% de probabilidade. As comparações também foram realizadas entre os grupos tratados e os controles G1 e G2, sendo que, para o mesmo, foi aplicado o teste de Dunnet à 5% de probabilidade. Os resultados não mostraram diferenças significativas entre o grupo controle (G1) e o grupo osteoporótico (G2), bem como, entre eles e os grupos tratados (G3, G4 e G5) e, também, entre os grupos tratados entre si, em todos os períodos, quanto aos valores sérico de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina óssea, tanto no primeiro, como no segundo ensaio biológico. Assim, estes marcadores bioquímicos não apresentaram indícios para condução de diagnóstico e acompanhamento da patologia óssea osteoporótica. Todavia, os valores percentuais de densidade trabecular óssea foram significativos em todos os períodos, quando se compara o G1, (±60%), com G2, (±40%), mostrando que a indução osteoporótica com o glicocorticóide dexametasona foi um sucesso. Quanto aos grupos tratados, comparados com o G2, constata-se que os tratamentos com alendronato de sódio (G3) e atorvastatina cálcica (G4), isoladamente, alcançaram valores percentuais de densidade trabecular óssea significativos, já no período de 14 dias, repetindo-se nos períodos de 21 e 28 dias e o tratamento com ipriflavona obteve valores significativos nos períodos de 21 e 28 dias. O grupo tratado com alendronato de sódio obteve valores semelhantes ao do grupo controle (G1), nos períodos de 21 e 28 dias. Demonstra-se, assim, a capacidade destas substâncias de restaurar o tecido trabecular ósseo nos animais osteoporóticos induzidos com glicocorticóide. As associações, por sua vez, apresentaram resultados superiores. Todos os grupos tratados (G3, G4 e G5) apresentaram resultados significativos em relação ao grupo (G2) nos períodos de 14, 21 e 28 dias. Ademais, o grupo G4 (alendronato + ipriflavona) mostrou valores significativos, acima dos apresentados pelo grupo controle (G1), que é constituído de animais normais, nos períodos de 14, 21 e 28 dias e o grupo G3 (alendronato + atorvastastina), nos períodos de 21 e 28 dias. Tornou-se evidente, que as associações resultaram em maior eficácia, particularmente, aquelas com alendronato, com capacidade de restaurar o tecido trabecular ósseo. Considerando que as doses individuais das substâncias associadas foram reduzidas à metade daquelas, quando administradas isoladamente, e os resultados foram superiores, caracteriza-se, assim, efeito sinérgico de supradição ou potenciação farmacológica. Muito embora os marcadores bioquímicos utilizados neste trabalho não demonstraram diferenças que evidenciasse alteração metabólica óssea, a histomorfometria e a histopatologia permitiu análise estática e dinâmica, bem como a avaliação das alterações tissulares na unidade metabólica óssea, especialmente, no osso trabecular. Deste modo, as substâncias usadas isoladamente ou as suas associações, podem ser promissoras no tratamento prolongado com glicocorticóide ou no tratamento da osteoporose estabelecida. Ressalva-se, no entanto, que estudos posteriores das dosagens, interações, biodisponibilidades, além dos efeitos toxicológicos dessas substâncias farmacológicas, fazem-se necessários.Item Tolerância ao estresse hídrico mediada pela proteína BiP de soja em plantas transgênicas de tabaco(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-31) Vaez, Juliana Rocha; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/7534198613724657A proteína de ligação (BiP) é um importante componente de resposta ao estresse no retículo endoplasmático (RE). Tem sido demonstrado que níveis elevados de BiP em tabaco transgênico de linhagens senso conferem tolerância à tunicamicina, um inibidor de glicosilação, durante a germinação e tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Para avaliar a função protetora de BiP contra estresses abióticos, linhagens homozigotas T3 expressando o gene BiP da soja na orientação senso e anti-senso, foram obtidas através de análises de segregação do loco do T-DNA das gerações T2 e T3. Sob déficit hídrico progressivo, níveis de BiP em folhas de linhagens transgênicas com a orientação senso estão correlacionados com a manutenção da turgidez de broto e do conteúdo de água, independentemente do grau de intensidade do estresse. Contudo, o efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico não é perdido na expressão do cDNA de BiP da geração T4 das linhagens homozigotas anti-senso. A suscetibilidade das linhagens anti-senso ao déficit hídrico foi similar aos controles, plantas não-transformadas. Esse resultado pode indicar que ocorreu seleção natural dos transformantes com baixa expressão do gene anti- senso nas gerações subseqüentes. O caráter essencial dos genes BiP pode levar a uma pressão seletiva para o silenciamento do gene anti-senso. A função de BiP na tolerância contra estresses do RE foi investigada na geração T3 de plantas transgênicas senso e anti-senso de N. tabacum. Aparentemente, a superexpressão constitutiva de BiP não atenuou a letalidade ocasionada pela inibição da glicosilação pela tunicamicina nas concentrações de 0,6 a 1,0 μg/mL. Nessas condições, a tunicamicina inibe a indução de brotos mais eficientemente em plantas superexpressando BiP do que nas selvagens. Análises de immunoblottings detectaram aumento no nível de BiP nas concentrações de tunicamicina de 0,8 e 1,0 μg/mL. A indução de BiP foi coordenada com o acúmulo de um produto de degradação de 25-28 kDA, indicando a existência de uma co-regulação entre a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e o sistema de degradação de proteínas associadas ao RE em células de plantas. O aumento no nível de BiP em discos foliares transgênicos senso foi similar ao observado em controles após o tratamento com tunicamicina. Entretanto, o tratamento de discos foliares senso não promoveu acúmulo adicional de BiP nem do produto de degradação de 25-28 kDa. Tais resultados evidenciam que o nível de BiP pode atuar como sensor para ativação de resposta a estresses em plantas. Portanto, elevados níveis de BiP em células de plantas inibem a ativação da via UPR e podem evitar a ativação do sistema ERAD.Item Hidrólise de oligossacarídeos de rafinose, presentes em produtos de soja, por α -galactosidases(Universidade Federal de Viçosa, 2003-07-31) Callegari, Carina Marin; Rezende, Sebastião Tavares de; http://lattes.cnpq.br/8476181374339592A ingestão de grãos de leguminosas, como a soja e derivados, resulta no aparecimento de sintomas desagradáveis, destacando-se a flatulência. Flatulência é resultante do metabolismo anaeróbico de α-1,6-galactosídeos de rafinose (RO: oligossacarídeos de rafinose) presentes nos grãos das leguminosas em geral. A remoção desses açúcares poderia aumentar o consumo de alimentos derivados de soja. A hidrólise enzimática dos RO, catalisada por α-galactosidases, parece ser o tratamento mais promissor para a redução do conteúdo de RO em produtos derivados de soja. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de α-galactosidases de várias fontes para hidrolisar os RO presentes no extrato desengordurado de soja e nos produtos melaço leve e pesado. Foram testadas α-galactosidase de sementes germinadas de soja e de Tachigali multijuga , α-galactosidases de Aspergillus terreus e de Penicillium griseoroseum. O processo de purificação do extrato enzimático, obtido de sementes de soja var. Monarca, embebidas por 60 h, consistiu das etapas de crioprecipitação, precipitação ácida, fracionamento com sulfato de amônio e cromatografias de filtração em gel e de troca iônica, resultando numa preparação contendo atividade de α-galactosidase. A enzima foi purificada 19,74 vezes, com rendimento de 36,64%. Atividade máxima de α- galactosidase foi detectada em pH 5,0 a 50 °C. Cerca de 90% da atividade enzimática original foi mantida, após pré-incubação por 4 h a 40 °C. Os valores de K M ap para ρNPGal, melibiose e rafinose foram de 0,47 mM, 1,46 mM e 3,43 mM, respectivamente. A enzima hidrolisou com maior intensidade o ρNPGal, seguido por rafinose, estaquiose e melibiose. Galactose, SDS, CuSO 4 , rafinose, estaquiose e melibiose atuaram como inibidores da atividade de α-galactosidase. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, mostraram redução de 100% de rafinose e 53% de estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C. Quando o extrato desengordurado de soja foi tratado com a α-galactosidase de Tachigali multijuga, a S1 de A. terreus e a de P. griseoroseum, constatou-se redução no teor de rafinose de 72%, 100% e 66%, e no teor de estaquiose de 49%, 100% e 100%, respectivamente, após incubação por 8 h, a 40 °C. A redução no teor de RO nos produtos melaço leve e pesado de soja, tratados com a preparação enzimática contendo atividade de α-galactosidase, foi de 100% para rafinose e 58% para estaquiose, após incubação por 8 h, a 40 °C, para ambos os produtos. Conclui-se que as α-galactosidases testadas hidrolisaram substancialmente os carboidratos não- digeríveis, rafinose e estaquiose, do extrato desengordurado de soja e dos produtos melaço leve e pesado de soja, indicando uma possível utilização destas enzimas em processos industriais, visando a diminuição dos RO e o aumento do uso da soja como fonte protéica vegetal na alimentação humana e animal.Item Natureza recombinante e propriedades patogênicas do DNA-A do begomovírus ToCMV-[MG-Bt1](Universidade Federal de Viçosa, 2003-02-26) Luz, Dirce Ferreira; Almeida, Márcia Rogéria de; http://lattes.cnpq.br/7597740439389337Espécies do gênero Begomovirus (família Geminiviridae) encontradas no hemisfério ocidental tem tipicamente um genoma bissegmentado que consiste em dois componentes genômicos de 2,6 Kb, denominados DNA-A e DNA-B. Atualmente, a grande diversidade de begomovírus patogênicos identificados tem sido explicada pela alta frequência de eventos de recombinação. Relatos adicionais também tem evidenciado a importância dos eventos de recombinação inter-espécies na evolução dos begomovírus e na sua emergência como patógenos relevantes na agricultura. Utilizando-se um programa computacional para detecção de recombinação foram observados eventos de recombinação estatisticamente significantes entre as sequências completas do componente DNA-A de begomovíus que infectam tomateiros, recentemente identificados no Brasil. As progênies recombinantes exibiram diferentes propriedades biológicas e propriedades patológicas aumentadas quando comparadas com os seus prováveis predecessores. O DNA-A de Tomato chlolorotic mottle virus ToCMV-[MG-Bt1], de Minas Gerais, da região de Betim, identificado e clonado por nosso grupo, possui um genoma híbrido no qual o módulo compatível de replicação (AC1 e a origem de replicação) foi provavelmente doado por ToCMV-[BA-Se1] e as sequências remanescentes parecem ter sido originadas de Tomato rugose mosaic virus (ToRMV). Apesar do alto grau de conservação de sequência com os seus predecessores, ToCMV-[MG-Bt1] difere significantemente nas suas propriedades biológicas. De fato, ToCMV-[MG-Bt1] infectou seu hospedeiro natural Lycopersicon esculentum, induziu sintomas atenuados e acumulou DNA viral nas folhas apicais na ausência de um DNA-B cognato. Foi caracterizada a patogenicidade deste DNA-A clonado e infeccioso através de uma gama de hospedeiros, e a efetividade foi avaliada via inclusão de um DNA-B compatível em ensaios de infectividade. O DNA-A de ToCMV-[MG-Bt1] sozinho é capaz de infectar sistematicamente e causar sintomas nos hospedeiros permissíveis Nicotiana benthamiana, Chenopodium amaranticolor e Chenopodium quinoa. Ele move-se sistematicamente em Datura stramonium, mas causa uma infecção assintomática. O acúmulo do DNA viral nas plantas infectadas foi confirmado por PCR. A inclusão de um componente B compatível nos ensaios de infectividade não alterou a sintomatologia das doenças mediadas pelo ToCMV-[MG- Bt1]-A, também não aumentou o nível do DNA-A nos hospedeiros permissíveis. Assim, os resultados deste trabalho forneceram evidências adicionais sobre os eventos de recombinação inter-espécies que podem desempenhar um papel significativo na diversidade dos geminivírus e na sua emergência como patógenos importantes na agricultura.