Bioquímica Agrícola
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Item Tolerância da soja a seca: respostas moleculares da superexpressão da chaperona BiP e da interação com fungo endofítico Pochonia chlamydosporia(Universidade Federal de Viçosa, 2021-10-27) Rodrigues, Juliano Mendonça; Ramos, Humberto J. de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/5196583036930660Tolerância da soja a seca: respostas moleculares da superexpressão da chaperona BiP e da interação com fungo endofítico Pochonia chlamydosporia. Orientador: Humberto Josué de Oliveira Ramos. Coorientadores: Elizabeth Pacheco Batista Fontes, Juliana Rocha Lopes Soares Ramos, Maria Goreti de Almeida Oliveira e Leandro Grassi de Freitas. Plantas, por estarem inseridas em um ambiente dinâmico e complexo, estão expostas a diversas mudanças das condições ambientais que podem limitar o seu crescimento e produtividade. Estresses abióticos como escassez hídrica e secas prolongadas são um desafio, uma vez que tendem a se tornar cada vez mais frequentes devido a eventos climáticos extremos. Como maior produtor e exportador mundial de soja, a agricultura brasileira tem um interesse especial nos mecanismos de tolerância cruzada a estresses bióticos e abióticos em soja. Por isso, diversos estudos buscam obter mecanismos de adaptação e resistência vegetal a estresses ambientais com o melhoramento da produtividade agrícola e o mínimo de impacto ao meio ambiente. Uma das linhas de pesquisa visa a manipulação da chaperona molecular BiP em plantas transgênicas, cuja resposta ao estresse osmótico e do retículo endoplasmatico podem favorecer a tolerância à seca em soja. Entretanto, são boladas as informações sobre os efeitos da superexpressão de BiP no atraso na ativação da morte celular provocada por reação de hipersensitividade em situações de estresse biótico provocado pela bactéria não compatível Pseudomonas syringae pv. tomato. Outra linha de pesquisa, o uso de produtos biológicos baseados em organismos simbiontes da rizosfera vegetal que colonizam como raízes vegetais, dentre os quais o fungo nematófago endofítico Pochonia chlamydosporia pode estimular a capacidade da raiz de soja em explorar o solo ao redor favorecendo-a em condições de restrição hídrica. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil morfológico, fisiológico e metabólico de genótipos contrastantes de soja quanto à tolerância a seca em resposta a interações bióticas. Foram analisadas a expressão de genes responsivos por RT-PCR, além da regulação diferencial de proteinas e fosfoproteinas responsivas à interação planta-bactéria no genótipo transgênico superexpressando BiP (C9) e (WT), sendo identificado por LC/MS- 2DE. Foram também adotados por LC-MS a abundância de fito-hormônios e alguns metabólitos especializados alvos em resposta à interação de soja com P. syringae pv. tomato e soja com P. chlamydosporia para determinar mudanças metabólicas básicas genótipos relacionados com a resposta à seca e/ou a resposta de defesa vegetal sob interações biológicas.Por sua vez, parâmetros morfofisiológicos de folhas, caule e raiz de genótipos tolerante a seca Embrapa48 e sensível a seca BR16 foram coletados ao longo do experimento planta-fungo. Concluiu-se que a via de síntese de flavonóides e isoflavonóides é uma das principais vias responsivas às inoculações com bactérias e com fungo em plantas, sendo determinante para a presença e contenção do hospedeiro. A resposta hipersensitiva bacteriana provocou uma expressão de genes que modulam a morte celular, sobretudo no genótipo transgênico, uma redução negativa de proteinas da fotossintese e uma regulação positiva de proteinas do metabolismo antioxidativo e do metabolismo dos fenilpropanoides e flavonóides, especialmente O-metiltransferases. Por fim, a interação bacteriana regulou positivamente os níveis de flavonoides e fitoalexinas em genótipos infectados. A presença do fungo, por sua vez, produziu um atraso de um dia na queda do potencial hídrico em ambos os genótipos contrastantes quanto a seca. O aumento do turgor foliar e como mudanças nos níveis de fito- hormônios, poliaminas e compostos fenólicos indicam que uma associação da planta ao fungo nas condições de déficit hídrico é inerente a cada genótipo, sendo que nenhum genótipo é tolerante a seca está ligada às propriedades hidráulicas dos vasos condutores. A presença do fungo promove mudanças morfológicas no sistema radicular e no sistema de vasos condutores da parte aérea em Embrapa48 e, em menor extensão, em BR16. Esses resultados podem ajudar a elucidar os mecanismos predominantes na tolerância cruzada de estresses bioticos e abioticos concomitantes, e como as plantas como utilizam para promover uma maior adaptação ao ambiente. Palavras-chave: Glycine max. Pseudomonas syringae patovar chlamydosporia. Estresses ambientais. Metabolômica. Proteômica. tomato. PochoniaItem Obtenção e caracterização de celulases de fungos de podridão branca em fermentação no estado sólido e sacarificação da palha de sorgo visando a produção de etanol(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-24) Cardoso, Wilton Soares; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Rezende, Sebastião Tavares de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787599A3; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/4881556650652069; http://lattes.cnpq.br/2971805843184725; Coutrim, Maurício Xavier; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785465J7; Fernandes, Sergio Antônio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4760152Y5Buscando alternativas tecnológicas para o etanol, este trabalho estudou a produção de celulases por fermentação em estado sólido (FES), utilizando a palha do sorgo como substrato e cinco linhagens de fungos da podridão branca, Phanerochaete chrysosporium, Pycnoporus sanguineus, Trametes versicolor, Pleurotus eryngii e P. ostreatus. Avaliou-se também a palha do sorgo, quanto ao seu potencial diante dos pré-tratamentos e hidrólise enzimática para a produção de etanol celulósico. Dos pré-tratamentos avaliados, ácido, básico e ácido seguido por deslignificação, o pré-tratamento básico da palha do sorgo BRS 655 foi suficiente para proporcionar uma alta digestibilidade enzimática, alcançando 85% de hidrólise por uma enzima comercial. A palha de sorgo utilizada se mostrou um substrato adequado para a produção de celulases em FES por fungos da podridão branca. Dentre as enzimas estudadas, destacou-se a β-glicosidase termoestável do P. sanguineus. Na sacarificação da palha e polpas pré-tratadas, o complexo (extrato) multi celulases do P. chrysosporium hidrolisou 50% da polpa básica, após 72 h. e com carga de 8 FPU.g-1 de biomassa. Em condições semelhantes, uma enzima comercial alcançou apenas 3% de hidrólise. Nos coquetéis dos extratos, a atividade de FPAse aumentou significativamente para todos os coquetéis dos cincos fungos, em comparação com os extratos individuais de cada fungo. O coquetel mínimo para a máxima atividade de FPAse foi de 100 μL de extratos de cada um dos fungos, P. sanguineus, P. chrysosporium, P. ostreatus, P. eryngii, e 200 μL do T. versicolor.Item Produção e caracterização bioquímica de fitases de Rhizopus stolonifer e Aspergillus niger UFV-1 e suas aplicações em ração animal(Universidade Federal de Viçosa, 2011-09-29) Monteiro, Paulo Sérgio; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Rezende, Sebastião Tavares de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787599A3; http://lattes.cnpq.br/9968171263899224; Lanna, Eduardo Arruda Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788116T3; Oliveira, Eduardo Basílio de; http://lattes.cnpq.br/4091528830821027; Fontes, Elita Scio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794299J7Neste trabalho, duas cepas fúngicas isoladas da castanha macadâmia e de bagaço de cana-de-açúcar foram avaliadas quanto ao potencial para produção de fitases, visando aplicação em processos biotecnológicos, principalmente em rações animais. O fungo Rhizopus stolonifer, isolado a partir da macadâmia, foi cultivado em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20, e CaCl2, utilizando a metodologia de superfície de resposta (MSR) para otimizar a produção de fitases. O uso da MSR resultou em uma atividade enzimática de 0,65 U/mL, valor nove vezes maior em relação à atividade inicial de fitases. A enzima apresentou pH e temperatura ótimas na faixa de 5,0-5,5 e 65 oC, respectivamente, com t1/2 de 50 minutos a 50 ºC. Os valores de KM app e Vmax app foram 0,692 mM e 0,780 Tmol/min, respectivamente. A enzima mostrou-se eficiente na hidrólise de fitato em ração animal, liberando 5,14 Tmol PO4 3-/mL após 5 horas de tratamento. Esse valor é equivalente à concentração inicial de fósforo. O fungo Aspergillus niger UFV-1, isolado de bagaço de cana-de-açúcar, também foi cultivada em meio líquido contendo infusão de batata, sacarose, peptona, Tween-20 e CaCl2. Após oito dias de incubação, o extrato enzimático produzido foi coletado e analisado para a atividade enzimática de fitases. A enzima foi purificada por ultrafiltração, precipitação ácida e cromatografias de troca iônica e gel filtração. A fitase apresentou massa molecular de 161 kDa, determinada por gel filtração e 81 kDa, determinada por eletroforese SDS-PAGE, sugerindo que a enzima é formada por duas subunidades. Os valores de pH e temperatura ótimos foram de 2,0 e 60 ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos, KM e Vmax, determinados pela equação de Lineweaver-Burk, foram 30,9 mM e 7,48 Tmol/min, respectivamente. A kcat estimada foi de 1,46 x 105 s-1 e kcat/KM foi igual a 4724919 s-1.M-1. A fitase mostrou elevada termoestabilidade, com t1/2 de 6,2 horas a 80 ºC e foi resistente a pepsina e tripsina. Além disso, foi eficiente na liberação de fósforo, quando avaliada em ração animal comercial, liberando 15,3 Tmol PO4 3-/mL, valor equivalente a quatro vezes a concentração inicial de fósforo. Os resultados obtidos sugerem que as duas cepas fúngicas avaliadas têm grande potencial como produtoras de fitases para aplicação industrial, principalmente a cepa de Aspergillus niger UFV-1, cuja fitase apresentou pH ótimo ácido e elevada resistência a proteases.