Bioquímica Agrícola
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Item Isolamento e identificação do perfil de zeinas do germoplasma tropical de milho para produção de cobertura comestível e biofilme(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-13) Sant’ana, Rita de Cássia Oliveira; Oliveira, Maria Goreti de AlmeidaProlaminas referem-se a uma classe de proteína de armazenamento solúvel em álcool presentes nos cereais, sendo que essas proteínas são chamadas zeínas no grão de milho. Esse grupo de polipeptídeos de diferente peso molecular é responsável por mais de 50% das proteínas totais do milho e é comumente extraída da farinha de glúten de milho, um subproduto do processamento de moagem a seco de milho, que contém até 70% de zeinas. Quatro tipos de zeína, α, β, γ e δ já foram identificadas, apresentando essas diferentes sequências aminoacídicas e pesos moleculares. Solução aquosa de álcool é utilizada para extrair α-zeína diretamente, ao passo que a extração das outras zeinas requer um agente redutor, principalmente o β-mercaptoetanol. Isso limita o uso direto de filmes a base de zeinas nos alimentos. Realizar o perfil cromatográfico de diferentes padrões pertencentes ao Banco Germoplasma utilizando um novo método de extração da zeína usando agente redutor não tóxico e avaliar a utilização dessa proteína isolada na produção de filmes e coberturas comestíveis. Quatro métodos diferentes de isolamento foram testados, três já publicados na literatura e um novo método com agente redutor não tóxico. O perfil das frações de proteína extraídas foi obtido por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), sendo as zeínas extraídas utilizadas na produção de filmes e coberturas. O perfil eletroforético das prolaminas do milho permitiu identificar a presença de quatro frações de zeína nos materiais extraídos na presença de um agente redutor, não havendo nenhuma diferença desses perfis dos isolados obtidos com agente redutor não tóxico. Sendo assim, a substituição do agente redutor tóxico na extração de zeínas pode ser uma alternativa para viabilizar a aplicação de zeína extraída extraida diretamente do grão de milho diretamente na produção de biofilmes com a finalidade de aplicação na indústria alimentícia. A cobertura de zeína ficou evidenciado que o armazenamento utilizando a cobertura de zeína foi eficiente para manter a umidade dos grãos das espigas e aumentar a luminosidade e brilho. Esse aspecto já é positivo levando em consideração que a perda da umidade das espigas gera o murchamento dos grãos e, consequentemente, perda na vida de prateleira dos mesmos, assim como a luminosidade melhora o aspecto visual das espigas. Sendo assim, sugere-se mais estudos com relação à composição da cobertura de zeína para que possa haver melhorias em outros aspectos de conservação.Item Avaliação da atividade antimelanoma in vitro e in vivo de um derivado de dibenzoilmetano de uso tópico(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-31) França, Andressa Antunes Prado de; Diaz, Marisa Alves Nogueira; http://lattes.cnpq.br/1081080156647658O câncer, atualmente, é a segunda causa de morte por doenças no Brasil, e o câncer de pele do tipo melanoma é a principal causa de morte dentre as afecções da pele. Neste sentido, considerando-se o impacto social e relevância da doença, buscam-se novas opções de terapias que sejam mais eficazes contra esses agravos. Os dibenzoilmetanos constituem uma classe de compostos que vem sendo amplamente investigada, devido às suas já conhecidas propriedades fotoprotetoras, anti-inflamatórias e antitumorais. Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação das propriedades antimelanoma de um derivado de dibenzoilmetano com finalidade de aplicação tópica. O composto 1,3-Difenil-2-benzil-1,3-propanodiona foi sintetizado a partir de 1,3-difenil-1,3-propanodiona (dibenzoilmetano). Os ensaios in vitro de citotoxicidade com MTT foram realizados com 3 x 10 3 células plaqueadas por poço em placas de 96 poços, e o composto nas concentrações 0,25 µg/mL, 2,5 µg/mL, 25 µg/mL e 250 µg/mL, com tratamento das células por 48h. O composto apresentou IC 50 de 53,05 µg/mL para as células da linhagem B16F10, derivadas de melanoma murino, e 225,5 µg/mL para as células da linhagem melan-A, derivadas de melanoblastos normais murino, com índice de seletividade de 4,25. Isto significa que o composto é 4,25 vezes mais seletivo para as células de melanoma do que para os melanócitos, o que indica potencial terapêutico para testes in vivo. O teste in vivo foi realizado com base em um modelo de melanoma murino, utilizando-se camundongos da linhagem C56Bl/6, com inoculação subcutânea de 1 x 10 5 células B16F10 na região cervical, e tratamento tópico no mesmo sítio onde foi induzido o tumor. O tratamento foi realizado utilizando-se um gel transdérmico, contendo o composto nas concentrações de 1 mg/mL e 3 mg/mL, e 2% de Aristoflex® como agente gelificante, 5% de propilenoglicol como umectante, 10% de dimetilsulfóxico (DMSO) como promotor de absorção e álcool 70% como inibidor microbiano (q.s.p). O tratamento foi iniciado 24 horas após a indução do tumor, e durou 21 dias. Terminado este período, os animais foram eutanasiados, e foram coletados o tumor, fígado, rim e pulmões dos animais para análises histológicas, além do sangue, para análise do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) do soro. A avaliação do volume tumoral indicou diferenças significativas entre os animais não tratados e os animais tratados, com os animais tratados apresentando menores tumores. Além disso, o VEGF também se apresentou aumentado nos animais não tratados, o que pode representar um possível mecanismo pelo qual o composto esteja agindo sobre as células tumorais. A avaliação histológica das amostras de tumor mostraram amplas áreas necróticas no material coletado a partir dos animais tratados, e indicativos de morte celular por apoptose. Ademais, o fígado se apresentou mais preservado nos animais tratados do que nos animais doentes sem tratamento, ou tratados com a formulação sem o composto ativo (branco). Nas amostras de rim não foram encontradas alterações histológicas, e nas amostras de pulmão, não foi identificado nenhum foco de metástase. A partir destes resultados, pode-se concluir que o composto apresentou significativo papel terapêutico contra o melanoma, com base na rota de distribuição transdérmica da droga.Item Estudo biomonitorado do extrato acetato de etila do fungo Fusarium oxysporum(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-18) Mendonça, Vitor Romito de; Diaz, Marisa Alves Nogueira; http://lattes.cnpq.br/3652068457679482Fusarium oxysporum é um fungo fitoparasita facultativo, encontrado na rizosfera de várias plantas. Essa espécie é responsável por atacar diversas plantas do agronegócio brasileiro, causando grandes perdas devido à produção de micotoxinas. Contudo, ele pode produzir outros metabólitos que possam ser de interesse humano. O presente trabalho procurou investigar a ação antibacteriana de metabólitos produzidos por Fusarium oxysporum. Para isso, o fungo foi crescido em meio líquido, caldo de batata e dextrose, durante 10 dias. Extratos orgânicos foram obtidos tanto do micélio quanto do meio líquido e atividade antibacteriana foi avaliada. Os extratos que apresentaram atividade foram purificados por biomonitoramento. Do extrato do micélio foi isolada uma substância de intensa coloração vermelha em forma de cristais de agulha que apresentou atividade antibacteriana (31,25 µg.mL -1 ). Através da cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas determinou-se sua massa molecular [M+H] de 419,2646. Varredura de espectroscopia no ultravioleta-visível mostrou que a substância apresenta absorção máxima em 259 e 520 nm, respectivamente. Contudo, espectros de RMN de hidrogênio e de carbono não puderam ser obtidos com precisão devido à baixa solubilidade da substância em solventes deuterados. O ensaio de partição demonstrou que o composto apresenta solubilidade em solvente orgânico quando em meio ácido e forma uma emulsão quando em meio básico, sugerindo que o mesmo sofre ionização na presença de base. Técnicas de cristalografia serão posteriormente efetuadas para se determinar a estrutura da substância. Os resultados obtidos sugerem uma potencial utilização da substância como biosensor devido a mudança de pH e a sua atividade antibacteriana, assim como corante devido a sua intensa coloração.Item Caracterização química, nutricional e potencial antioxidante da polpa dos frutos de Euterpe edulis Martius e sua avaliação nos fatores de risco e nas lesões ateroscleróticas em camundongos apoE -/-(Universidade Federal de Viçosa, 2012-07-30) Cardoso, Luciana Marques; Leite, João Paulo Viana; http://lattes.cnpq.br/7846855075166389A espécie Euterpe edulis Martius, da família Arecaceae, popularmente chamada de palmeira juçara e pertencente ao mesmo gênero botânico do açaizeiro da Amazônia (Euterpe oleracea Martius) produz frutos de coloração roxa intensa, devido, principalmente, à presença de antocianinas. As antocianinas possuem propriedades antioxidantes e antiinflamatórias e há evidências que podem contribuir para a redução da progressão de lesões ateroscleróticas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a composição química, nutricional e o potencial antioxidante da polpa liofilizada dos frutos de E. edulis (PLFE) e avaliar seu efeito nos fatores de risco e nas -/- lesões ateroscleróticas em camundongos ApoE . Foi encontrado por HPLC- DAD e HPLC-ESI-MS a presença de seis antocianinas, sendo a cianidina 3- rutinosideo (440 mg/100g) e a cianidina 3-glicosideo (147 mg/100g) as predominantes. Na PLFE também foi identificado outros compostos como polifenóis, flavonóides, saponinas, β -caroteno e minerais, como o Ca, P, Na, K, Mg, Zn, Fe, Cu e Mg. A composição centesimal da PLFE apresentou 6,98% de proteína, 41,4% de lipídios e 42,17% de carboidratos, sendo que destes 71,89% e 10,85% é representado por fibra insolúvel e fibra solúvel, respectivamente. Com relação ao perfil lipídico da PLFE, foi identificado um alto conteúdo de ácidos graxos insaturados (72,93%), sendo que destes 33,02% e 39,91% foram constituído de ácidos graxos monoinsaturados e poliinsaturados, respectivamente. A PLFE apresentou atividade antioxidante, mensurada por DPPH, sendo o valor de EC50 de 81,7 ppm. Os tratamentos com a PLFE foram também comparados com o acetato de α-tocoferol e ambos reduziram fatores de risco associados a aterosclerose. Os resultados in vivo sugeriram atividade antioxidante da PLFE, acarretando na diminuição significativa da atividade da catalase em todos os tratamentos com a PLFE (doses de 2, 6 e 10%) e no grupo que recebeu acetato de α-tocoferol (G6), em relação ao controle positivo (G2). A atividade da superóxido dismutase e os níveis de triglicerídeos plasmáticos foram reduzidos no G4, que recebeu a dose de 6% de PLFE na dieta. Uma atividade antiinflamatória da PLFE na dose de 10% pode ser destacada, através da redução de infiltrados inflamatórios, das gotículas de lipídeos e de colágeno no fígado dos camundongos apoE -/- , componentes estes associados a processos inflamatórios como a esteatose e a fibrose hepática. Nossos resultados sugerem que compostos presentes na PLFE, como as antocianinas, fibras, ácidos graxos insaturados, vitaminas e minerais, podem contribuir para reduzir fatores de risco associados à aterosclerose.Item Efeito de berenil, um inibidor de proteases do tipo bis- benzamidina, nas respostas bioquímica, fisiológica e comportamental de lagarta da soja Anticarsia gemmatalis(Universidade Federal de Viçosa, 2010-10-21) Paixão, Gilson Petrônio da; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/1409937420632952A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, por ser considerada uma das principais pragas da cultura da soja, tem sido alvo de estudos visando a busca de alternativas para o seu controle. A utilização de inibidores de proteases (IPs) como alternativa para o controle de pragas tem sido amplamente estudada. Sabe-se que uma rota de defesa vegetal, talvez a mais conhecida, é denominada rota octadecanóide (ou via das lipoxigenases), a qual culmina com a produção do ácido jasmônico: um hormônio vegetal que ativa genes que expressam inibidores de proteases, tidos como agentes anti-metabólicos, pois levam os insetos a uma deficiência protéica. Os IPs atuam no intestino médio dos herbívoros, inibindo a ação das proteases sobre as proteínas provindas da alimentação, havendo, portanto, uma redução na disponibilidade de aminoácidos ao inseto, podendo resultar no atraso do crescimento e reprodução desses herbívoros e, consequentemente, na sua morte. Este trabalho teve por objetivos avaliar a capacidade da planta da soja de responder ao ataque de A. gemmatalis através da via das lipoxigenases e as respostas bioquímica, comportamental e fisiológica da lagarta da soja a concentrações crescentes do inibidor sintético de serino-proteases, berenil. Para tal, as lagartas foram alimentadas com plantas de soja da variedade IAC-PL-1, pulverizadas com berenil nas doses 0,0; 0,008; 0,01; 0,20; 0,60; e 1,0% (p/v ) e com plantas de soja das variedades IAC-18, IAC-24 e FOSCARIN-31 contendo 0,0; 0,60; e 1,0% (p/v) de berenil. Nas quatro cultivares testadas, observou-se que após o ataque da lagarta da soja ocorreu um aumento no pool de lipoxigenases nas folhas, o que levou a uma alta produção de inibidores de protease. Nas lagartas que foram alimentadas com plantas da variedade IAC-PL-1, observou-se interferência de berenil na resposta comportamental desses insetos, que tiveram preferência por plantas que não receberam pulverizações com o inibidor, o mesmo não sendo observado para as mariposas com relação à preferência para oviposição. Com relação ao desenvolvimento pós-embrionário, ocorreu uma redução significativa no ganho de peso. Foi observada também uma significativa redução na sobrevivência e no tempo de vida das larvas alimentadas com as maiores doses do inibidor. Além disso, houve inibição das atividades proteolítica e tríptica do intestino das lagartas nas quatro cultivares de soja. Os resultados obtidos indicam que a utilização de berenil é uma estratégia promissora para o controle da lagarta da soja e possivelmente de outros insetos-praga que tenham a tripsina como principal enzima digestiva.Item Pré-tratamento ácido e básico de bagaço de cana-de-açúcar e sacarificação enzimática(Universidade Federal de Viçosa, 2013-09-16) Canevari, Glauco da Cruz; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/3287594031224262O uso de subprodutos agroindustriais como a biomassa são usados para gerar o etanol de segunda geração. Essa estratégia é uma opção para aumentar a produção deste combustível em 30 % sem aumentar a área plantada de cana. Dessa forma, essa estratégia pode contribuir para diminuir o uso do petróleo e seus derivados, contribuindo significativamente para a redução dos impactos ambientais. Para que a produção de etanol celulósico seja economicamente viável é necessário que estas fontes lignocelulósicas sejam fracionadas de forma a disponibilizar a maior quantidade de carboidratos possível para o processo de fermentação alcoólica. No primeiro capítulo é apresentado uma revisão sobre os diferentes métodos de pré- tratamentos existentes que vem sendo utilizados abordando suas vantagens e desvantagens nos processos de produção de etanol. No segundo capítulo foi investigado o pré-tratamento de bagaço de cana de açúcar com ácido sulfúrico diluído e hidróxido de sódio e sacarificação enzimática. Buscou-se maximizar o rendimento de glicose na hidrólise enzimática de ambos os tratamentos. Foram examinadas várias condições de pré-tratamento com ácido sulffidrico aplicando o planejamento fatorial fracionado 2³: concentração de H2SO4 de 0,5-2% (g/L), tempo de reação de 10-50 minutos, a relação sólido-líquido de 0,5-1,5 (g/L) e temperatura constante de 121°C. A análise variância (ANOVA) mostrou que a associação dos fatores utilizados nos pré-tratamentos, não teve efeito significativo (p <0,05). O pré-tratamento que apresentou melhores rendimentos em glicose foi nas seguintes condições: 1,25% de ácido sulfúrico no tempo de 30 minutos de experimento e com relação sólido-líquido de 1,0. A temperatura foi mantida constante (121°C) em todas as condições testadas. Esta condição pré-tratamento utilizada reduziu 65,7 % o teor de hemicelulose e aumentou em 16,3 % o teor de celulose devido a solubilização da hemicelulose. As concentração de produtos gerados na degradação do açúcar, tais como o ácido acético (2,91 + ou - 0.03), furfural (0,12 + ou - 0,00), 0 hidroximetilfurfural (0,03 + ou - 0,00) (g/L), foram baixos em relação a outros trabalhos na literatura, sugerindo o bom potencial do hidrolisado para fermentação. Esses resultados indicam que a solubilização de hemiceluloses (65,7 %) favoreceu alto rendimento de glicose na hidrólise enzimática (36,1 g/L) quando comparada ao material in natura (5 g/L). Espectro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) foi usado para determinar os principais constituintes presentes nas fibras do bagaço antes e após o pré- tratamento ácido somente. A principal diferença apresentada entre os espectros de infravermelho do bagaço de cana in natura e o pré-tratado foi encontrada em 585 e 3500 cm-¹ que referem à deformação assimétrica de grupos (C-OH) de celulose e possível estiramento de grupos (0-H) de polissacarídeos. A degradação térmica do bagaço de cana apresentados na termogravimetria apresentou dois passos de perda de massa atribuídos a liberação de umidade e decomposição do material lignocelulósico. A principal diferença apresentada entre as análises térmicas do bagaço de cana in natura e o pré-tratado no presente trabalho foi encontrada em temperaturas em torno de 200 a 400 °C que referem a degradação térmica principalmente de hemicelulose seguida de celulose. Após as etapas de pré-tratamento, os materiais lignocelulésicos apresentaram uma estrutura morfológica modificada, com as células vegetais livres de células de parénquima, conforme verificado pelas análises de Microscopia eletrônica de varredura (MEV). O pré-tratamento ácido gerou mudanças na conformação estrutural que desorganizou o bagaço e, posteriormente, facilitou o acesso das enzimas no processo de hidrólise enzimática. Foram examinadas várias condições de pré-tratamento com hidróxido de sódio após o tratamento ácido aplicando o planejamento fatorial fracionado 2³: concentração de NaOH de 1-2% (g/L), tempo de reação de 30-90 minutos, a relação sólido-líquido de O,5-1,5 (g/L) e temperatura constante de 121°C. 0 pré-tratamento básico que apresentou melhores rendimentos em glicose foi nas seguintes condições: 1% de hidróxido de sódio no tempo de 30 minutos de reação 6 com relação sólido-líquido de 1,5. A temperatura foi mantida constante (121°C) em todas as condições testadas. O coeficiente da variável S/L foi significativo e negativo, indicando que ao aumentar a relação sólido/líquido observa-se um maior rendimento em glicose na sacarificação enzimática. A ANOVA indicou que não houve ajuste do modelo, portanto a superfície de resposta não é confiável.Item Enzimas lignocelulolíticas de fungos de podridão branca e fitopatógenos: produção, caracterização e aplicação em processos de sacarificação da biomassa(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-25) Falkoski, Daniel Luciano; Rezende, Sebastião Tavares de; http://lattes.cnpq.br/7062387416309293Neste trabalho, seis diferentes cepas fúngicas isoladas de plantações de eucalipto foram avaliadas quanto aos seus potenciais para produção de enzimas lignocelulolíticas visando suas aplicações em processos biotecnológicos, mais precisamente, processos de sacarificação da biomassa. Os fungos Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolado J-129 (um basidiomiceto não identificado), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis foram cultivados em meio líquido (ML) e meio semi- sólido (MSS) contendo farelo de trigo, sabugo de milho, polpa Kraft e celulose microcristalina (Avicel) como fonte de carbono. Após 4, 8 e 12 dias de fermentação os extratos enzimáticos produzidos foram coletados e analisados para determinação das atividades de xilanase, endoglicanases, β-glicosidases, lacases e celulase total (FPase). Pycnoporus sanguineus apresentou as maiores atividades para FPase (polpa Kraft-MSS) e lacase (farelo de trigo-ML) sugerindo que este microrganismo pode ser utilizado como um eficiente produtor de ambos os grupos de enzimas: cellulases e ligninases. Chrysoporthe cubensis propiciou as maiores atividades para endoglicanase e β-glicosidase (farelo de trigo-SSF). Sendo assim, foi demonstrado pela primeira vez que C. cubensis possui um grande potencial para produção de enzimas (principalmente celulases) para aplicação em processos de sacarificação da biomassa. As maiores atividades xilanolíticas foram encontradas em extratos produzidos pelo fitopatógeno C. pteridis, o qual foi apto a secretar quantidades incomuns de xylanase (aproximadamente 150000 U L -1 ) quando cultivado em meio semi-sólido usando farelo de trigo como substrato. Pycnoporus sanguineus e C. cubensis secretaram as maiores atividades celulolíticas e por isto os extratos enzimáticos produzidos por estes microrganismos foram caracterizados e subseqüentemente aplicados em testes de sacarificação da biomassa. Além de celulases e xilanases, P. sanguineus e C. cubensis também mostraram uma marcante capacidade para secretar atividades de α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase e poligalacturonase. Além disto, baixas atividades para β-xilosidase e β-manosidase também foram detectados em ambos os extratos enzimáticos. As atividades celulolíticas (endoglicanase, FPase e β-glicosidase) e xilanolíticas produzidas por P. sanguineus e C. cubensis foram caracterizadas em relação a pH e temperatura ótimos e foi observado que todas as atividades enzimáticas analisadas foram maximamente ativas quando incubadas em uma faixa de pH entre 3,5 e 4,5. Os valores de temperaturas ótimas variaram entre 50 e 60 °C. Além disto, todas as atividades enzimáticas foram altamente estáveis nas temperaturas de 40 e 50 °C tendo mantido mais de 70 % de suas atividades residuais após 48 h de incubação. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis foram aplicados em experimentos de sacarificação utilizando bagaço de cana, previamente submetido à pré-tratamento ácido ou básico, como substrato e os resultados de sacarificação foram comparados com aqueles obtidos utilizando- se uma preparação comercial de celulases. O uso de pré-tratamento ácido foi pouco eficiente na remoção da lignina junto ao bagaço de cana e como conseqüência disso observou-se um baixo rendimento de sacarificação quando este substrato foi utilizado, independentemente do extrato enzimático aplicado. Por outro lado, quando bagaço pré-tratado com base foi utilizado como substrato, elevadas taxas de hidrólise foram observadas. Considerando-se a produção de equivalentes açúcares redutores, foram observados rendimentos de sacarificação de 89,0, 60,4 e 64,0 % após 72 h de reação nos ensaios conduzidos com extrato de C. cubensis, extrato de P. sanguineus e com a preparação de celulases comercial, respectivamente. A produção de glicose também foi avaliada e, similarmente, se observou uma maior liberação deste monossacarídeo nos ensaios realizados com extrato do fungo C. cubensis (52,7 %). Para os ensaios de sacarificação utilizando extrato de P. sanguineus e celulase comercial a produção de glicose observada correspondeu a 22,6 e 36,6 % do rendimento teórico possível, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que as seis cepas fúngicas avaliadas neste trabalho têm grande potencial como produtoras de enzimas para aplicações em processos biotecnológicos. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis demonstraram um grande potencial para serem utilizados em processos de sacarificação da biomassa uma vez que o desempenho de hidrólise observado para estes extratos foi similar ou superior àquele observado em ensaios utilizando-se uma preparação de celulases comercial.Item Prospecção em folhas de pimentão `Sunshine ́ de peptídeos antimicrobianos com ação contra fitopatógenos e estruturação do banco de dados sobre defensinas DefDB(Universidade Federal de Viçosa, 2010-01-27) Magalhães, Rubens Daniel Miserani; Baracat-Pereira, Maria Cristina; http://lattes.cnpq.br/8570709158040295Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são expressos por muitos organismos e apresentam uma função multifacetada. Estudos os têm revelado como potenciais agentes antibacterianos, defensivos agrícolas, medicamentos cicatrizantes, imuno-moduladores, agentes quimiotáticos, entre outros. Defensinas, a maior família dos peptídeos antimicrobianos, são moléculas com prevalência catiônica, ricas em cisteínas, apresentando em geral três ou quatro pontes dissulfídicas. São constituídas de 45 a 54 resíduos de aminoácidos, encontradas em organismos vertebrados e invertebrados, apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos e vírus encapsulados. Essas moléculas apresentam baixa toxicidade a animais e plantas, justificando assim seu uso como drogas ou defensivos agrícolas. As defensinas atuam por meio de atrações eletrostáticas com a face externa das membranas celulares alvo, gerando poros e ocasionando morte celular. Elas também atuam, segundo estudos recentes, como sinalizadores primários e secundários em vias apoptóticas e como agentes potencializadores das defesas imunológicas, sendo o mecanismo de atuação molecular ainda desconhecido. A busca por AMPs de plantas tem sido realizada no Laboratório de Proteômica e Bioquímica de Proteínas (DBB/UFV) visando à caracterização estrutural desses peptídeos. O isolamento de peptídeos antimicrobianos de extratos solúvel (ES) e de parede celular (EP) de folhas de pimentão da variedade Sunshine foi realizado por etapas pré-cromatográficas (centrifugações, fracionamento salino e por ultrafiltrações) e por cromatografia líquida multidimensional offline. As frações de interesse obtidas de ES e de EP foram testadas em relação à sua atividade antimicrobiana contra o fungo Alternaria solani e contra as bactérias Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Gram positiva, e Ralstonia solanacearum, Gram negativa, pela técnica de microplacas, evidenciando a inibição do crescimento desses microrganismos. Os resultados sugerem a ocorrência de aglomerações dos AMPs nos extratos, dadas as características de hidrofobicidade e cargas desses peptídeos, e que as etapas de separação por massas moleculares devem ser realizadas visando reduzir esses efeitos. O procedimento experimental proposto ao final do trabalho, que envolve o fracionamento por sal e por ultrafiltração, seguindo-se cromatografia de fase reversa em C4, permitiu a separação das amostras em frações com atividades antimicrobianas diferentes e potencialmente de interesse para a exploração comercial na defesa de plantas. A construção de um banco de dados que agrupe informações sobre defensinas, possibilitando evidenciar relações entre as moléculas já conhecidas e sequências não identificadas, apresenta-se de grande importância para a complementação dos estudos crescentes sobre esses peptídeos. As bases de dados do DefDB já estão disponíveis e podem ser utilizadas para identificação de sequências obtidas por métodos de sequenciamento, seja pelo alinhamento com a sequência obtida, ou pela identificação comparativa utilizando ferramentas computacionais específicas, como programas e pipelines utilizados para análises de dados de espectrometria de massa. Assim, as informações obtidas desse banco de dados, com a ajuda de ferramentas de análises já disponíveis na rede mundial de computadores, podem colaborar para a identificação de novas sequências, para a elucidação do mecanismo de atuação molecular, além de contribuir para direcionar estudos iniciais sobre esses peptídeos. Portanto, a obtenção de frações com alta atividade antimicrobiana, juntamente com o desenvolvimento de bases de dados específicas, que facilitem a identificação dos possíveis peptídeos antimicrobianos presentes nessas frações, pode ser o caminho para o estudo e o isolamento de novos compostos naturais, capazes de substituir defensivos agrícolas danosos ao ambiente, e/ou serem utilizados como base de medicamentos para combater infecções e doenças imunológicas.Item Atividade antimelanótica de compostos fenólicos e extratos hidroalcoólicos de Inga subnuda e Rollinia dolabripetala e ação antibacteriana e antioxidante(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-31) Campos, Mateus Gandra; Oliveira, Tânia Toledo de; http://lattes.cnpq.br/5760087499859906Diante do contínuo aumento mundial de doenças como o câncer do tipo melanoma e infecções causadas por Staphylococus aureus resistentes à meticilina, a pesquisa por novos fármacos tem ganhado importância cada vez maior no mundo científico. O Brasil é um dos países com maior biodiversidade vegetal no mundo. Entretanto, muito pouco ainda se sabe sobre as propriedades terapêuticas desse patrimônio vegetal. O objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, o potencial citotóxico dos extratos hidroalcoólcios de Inga subnuda subsp. Luschnathiana (Benth.) T.D.Penn. (ingá) e Rollinia dolabripetala (Raddi) R.E. Fr. (araticum, marolo), dos flavonóides naringina e morina e de xantonas, sobre o câncer de pele do tipo melanoma, realizando um comparativo com a atividade do fármaco comercial 5-Fluoracil (5-FU). Os extratos também tiveram sua eficácia testada, in vitro, quanto ao seu potencial antioxidativo e potencial bactericida principalmente em cepas Gram-positivas. A avaliação da citotoxicidade foi baseada na linhagem B16F10 submetida ao ensaio colorimétrico do MTT. O extrato de I. subnuda apresentou ação bactericida contra todas as cepas bacterianas testadas, enquanto o extrato de R. dolabripetala apresentou atividade apenas contra S. aureus ATCC 29213. O extrato de I. subnuda desempenhou atividade antioxidante estatísticamente maior (p < 0,05) que os extratos de Gingko biloba (controle) e R. dolabripetala, tanto no teste do DPPH quanto no de peroxidação lipídica. No teste de citotoxicidade, a naringina foi considerada uma substância inativa para este tipo de câncerpatologia e a morina promoveu maior citotoxicidade no período de 72 horas (98,48% ± 0,71) com diferença significativa em relação ao controle (α < 0,05). Contudo, assim como a 1,7- dihidroxixantona, o potencial uso terapêutico da morina dificilmente será considerado devido a alta concentração necessária para desempenhar atividade citotóxica relevante (1,25x103 μg/mL). Assim, o extrato de ingá foi considerado o mais efetivo por, no tempo de 24, 48 e 72 horas, desencadear mais de 80% de citotoxicidade com a menor concentração (78,13 μg/mL). Os resultados indicam que ambos os extratos apresentam atividade antioxidante, antibacteriana e citotóxica, mas estudos posteriores são necessários para uma melhor compreensão das promissoras atividades biológicas dos extratos.Item Caracterização molecular e biológica do begomovírus Soybean chlorotic spot virus e construção de um vetor de silenciamento baseado na modificação de seu genoma(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-24) Côco, Daniela; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/9172176806887950O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA fita simples, transmitidos a espécies de plantas dicotiledôneas pela mosca-branca Bemisia tabaci. No Brasil, os begomovírus são um dos principais entraves para a produtividade do feijoeiro e tomateiro. Entretanto, begomovírus infectando soja (Glycine max) tem sido apenas esporadicamente relatados. Neste trabalho, foi isolado uma espécie do gênero Begomovirus infectando soja na região de Jaiba-MG e designado Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). Para a caracterização da espécie, foi feita a clonagem de seu genoma completo seguida de análise molecular, e da obtenção de clones infecciosos para a determinação de sua gama de hospedeiros. Extratos de DNA total de plantas infectadas foram utilizados para a amplificação do genoma viral completo utilizando-se a DNA polimerase do fago ф29. Os produtos da amplificação foram clonados em plasmídeos, completamente sequenciados e submetidas a análise filogenética. O DNA-A de SoCSV apresentou maior identidade de sequência com o vírus Macroptilium yellow spot virus (85% de identidade), enquanto o DNA-B apresentou maior identidade com o Bean golden mosaic virus (67% de identidade). Este nível de conservação de sequências de SoCSV é suficientemente dissimilar (menos que 89%) para ser considerado uma nova espécie de begomovírus. Nos testes de gama de hospedeiros, dentre as espécies testadas foi constatada a infecção viral nas espécies Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa, entretanto nenhum sintoma macroscópico foi observado. As plantas das espécies Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica e Glycine max, apresentaram sintomas leves. Os sintomas mais severos foram observados nas espécies Phaseolus vulgaris ‘Pérola’ e ‘Ouro Negro’, consistindo em deformação foliar, bolhosidade, clorose entre as nervuras, mosaico e mosaico dourado. Com o objetivo de induzir o silenciamento de genes em plantas de soja, foi construído um vetor de silenciamento viral baseado no DNA-A do SoCSV, denominado pUFV1713, através da substituição da maior parte da sequência que codifica a proteína capsidial (CP) por um sítio múltiplo de clonagem. Assim como os outros begomovírus, o SoCSV demonstrou não necessitar da proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. A capacidade de pUFV1713 induzir o silenciamento gênico foi testada com a inserção de um fragmento do gene magnesium chelatase subunit I (ChlI) no seu sítio múltiplo de clonagem, seguido por inoculação em plantas de soja. A infecção viral foi confirmada via PCR aos 21 dias pós-inoculação (dpi). O decaimento dos transcritos do gene endógeno ChlI foi avaliado por PCR em tempo real. Os dados do qRT-PCR confirmam a diminuição dos níveis de expressão do mRNA do gene ChlI nas plantas infectadas mas não nas plantas controles. Coletivamente, estes resultados indicam que o vetor VIGS derivado de SoCSV tem o potencial para aplicações em análises de genômica funcional de soja.