Bioquímica Agrícola
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Item Natureza recombinante e propriedades patogênicas do DNA-A do begomovírus ToCMV-[MG-Bt1](Universidade Federal de Viçosa, 2003-02-26) Luz, Dirce Ferreira; Almeida, Márcia Rogéria de; http://lattes.cnpq.br/7597740439389337Espécies do gênero Begomovirus (família Geminiviridae) encontradas no hemisfério ocidental tem tipicamente um genoma bissegmentado que consiste em dois componentes genômicos de 2,6 Kb, denominados DNA-A e DNA-B. Atualmente, a grande diversidade de begomovírus patogênicos identificados tem sido explicada pela alta frequência de eventos de recombinação. Relatos adicionais também tem evidenciado a importância dos eventos de recombinação inter-espécies na evolução dos begomovírus e na sua emergência como patógenos relevantes na agricultura. Utilizando-se um programa computacional para detecção de recombinação foram observados eventos de recombinação estatisticamente significantes entre as sequências completas do componente DNA-A de begomovíus que infectam tomateiros, recentemente identificados no Brasil. As progênies recombinantes exibiram diferentes propriedades biológicas e propriedades patológicas aumentadas quando comparadas com os seus prováveis predecessores. O DNA-A de Tomato chlolorotic mottle virus ToCMV-[MG-Bt1], de Minas Gerais, da região de Betim, identificado e clonado por nosso grupo, possui um genoma híbrido no qual o módulo compatível de replicação (AC1 e a origem de replicação) foi provavelmente doado por ToCMV-[BA-Se1] e as sequências remanescentes parecem ter sido originadas de Tomato rugose mosaic virus (ToRMV). Apesar do alto grau de conservação de sequência com os seus predecessores, ToCMV-[MG-Bt1] difere significantemente nas suas propriedades biológicas. De fato, ToCMV-[MG-Bt1] infectou seu hospedeiro natural Lycopersicon esculentum, induziu sintomas atenuados e acumulou DNA viral nas folhas apicais na ausência de um DNA-B cognato. Foi caracterizada a patogenicidade deste DNA-A clonado e infeccioso através de uma gama de hospedeiros, e a efetividade foi avaliada via inclusão de um DNA-B compatível em ensaios de infectividade. O DNA-A de ToCMV-[MG-Bt1] sozinho é capaz de infectar sistematicamente e causar sintomas nos hospedeiros permissíveis Nicotiana benthamiana, Chenopodium amaranticolor e Chenopodium quinoa. Ele move-se sistematicamente em Datura stramonium, mas causa uma infecção assintomática. O acúmulo do DNA viral nas plantas infectadas foi confirmado por PCR. A inclusão de um componente B compatível nos ensaios de infectividade não alterou a sintomatologia das doenças mediadas pelo ToCMV-[MG- Bt1]-A, também não aumentou o nível do DNA-A nos hospedeiros permissíveis. Assim, os resultados deste trabalho forneceram evidências adicionais sobre os eventos de recombinação inter-espécies que podem desempenhar um papel significativo na diversidade dos geminivírus e na sua emergência como patógenos importantes na agricultura.Item Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da proteína recombinante GmSBP2/S64 da soja (Glycine max)(Universidade Federal de Viçosa, 2006-06-09) Luz, Dirce Ferreira; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Oliveira, Marli Lourdes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4776566H8; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706238T7; Rezende, Sebastião Tavares de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787599A3; Martín, Francisco Javier Medrano; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4777240H8A proteína de ligação à sacarose (SBP) pertence à família das proteínas cupim e é relacionada estruturalmente às proteínas de armazenamento do tipo vicilinas. Nesta investigação, a SBP foi expressa em E. coli e grandes quantidades da proteína foi acumulada na fração insolúvel como agregados, proteína desnaturada. A renaturação da proteína purificada se deu com a remoção progressiva da uréia no tampão de renaturação, que continha um sistema de retirada de óxido (2 mM de glutationa reduzida e 0,2 mM de glutationa oxidada) e glicerol 5% (v/v) como um agente estabilizador de proteína. A renaturação da proteína foi monitorada usando o dicroísmo circular na faixa do UV distante (CD), a fluorescência intrínseca, e o apagamento por acrilamida, KCl e KI. A porcentagem da estrutura secundária da proteína renaturada, que foi calculada com base no espectro de CD, foi consistente com aquela obtida pelo modelamento teórico com grande predominância da estrutura de beta barril (42%) sobre a alfa-hélice (9,9%). O máximo da emissão de fluorescência de 303 nm para a SBP indicou que o triptofano fluorescente foi completamente internalizado dentro de um ambiente altamente hidrofóbico. Não obstante, o apagamento do triptofano pela acrilamida, KI e CsCL e respectiva constante de Stern-Volmer (Ksv) de 23,5 +- 0,5 M-1, 16,1 +- 0,2 M-1 e 4,9 +- 0,1 M-1 indicam que os resíduos de triptofano fluorescentes foram bastante acessíveis aos apagadores e, conseqüentemente, expostos ao solvente. Foi medida também a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) da ligação da sacarose por titulação da fluorescência usando a proteína renaturada. A baixa afinidade de ligação da sacarose (Kd = 2,79 +- 0,22 mM) à proteína renaturada foi similar àquela da proteína nativa purificada das sementes de soja. Coletivamente, os resultados apontam que a estrutura enovelada da proteína renaturada é similar à proteína SBP nativa. Como um membro da família das proteínas bicupim que incluem proteínas de armazenamento de semente altamente estáveis, foi de interesse determinar a estabilidade estrutural da SBP. As desnaturações térmicas e químicas da proteína foram examinadas por monitoramento das mudanças nos espectros de CD e na fluorescência intrínseca da proteína renaturada. Os resultados indicam que a SBP permaneceu enovelada em uma extensão similar na presença ou ausência de 8 M de uréia ou de 6 M de GdnHCl. Do mesmo modo, foi razoavelmente estável em altas temperaturas. A alta estabilidade da proteína renaturada pode ser uma propriedade remanescente da SBP de seu parentesco evolucionário com as proteínas de armazenamento de sementes.