Bioquímica Agrícola
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Item Purificação e atividade antibacteriana de peptídios sintetizados durante a germinação de sementes de soja (Glycine Max [L.] Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 2004-07-30) Barbosa, Meire de Oliveira; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://lattes.cnpq.br/3245761154557285Peptídios antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível, com consumo mínimo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs como parte da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Este trabalho visou identificar e purificar peptídios de sementes de soja sintetizados durante a germinação e avaliar a atividade antibacteriana, com o objetivo de desenvolver defensivos agrícolas naturais e agentes antimicrobianos para as indústrias farmacêutica e veterinária. Sementes de soja da variedade UFV 16 (Glycine max [L.] Merrill) foram germinadas por 24, 48, 72 e 96 h, trituradas e maceradas em 2,5 volumes do tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 contendo EDTA, PMSF e benzamidina. As sementes não germinadas foram moídas e adicionadas de tampão fosfato de sódio 25 mM na proporção de 1:5, contendo KCL, EDTA, tiouréia, PMSF e benzamidina. Os homogenatos de ambas foram mantidos sob agitação branda em geladeira por 2 h, centrifugados, e os sobrenadantes foram precipitados com sulfato de amônio. Cada sobrenadante foi aquecido a 80oC/15 min para precipitação diferencial de proteínas, e centrifugado. Seguiu-se cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-Sepharose com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,0, em equipamento tipo FPLC. O pool catiônico obtido foi submetido à cromatografia de troca catiônica em coluna CM-Sepharose com tampão MES 25 mM, pH 6,0, em equipamento tipo FPLC, e o pico eluído em 0,35 M de NaCl foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18-HPLC. Os perfis obtidos após cromatografia de fase reversa das sementes germinadas e não germinadas foram comparados para análise dos AMPs sintetizados durante a germinação. A semente germinada por 48 h mostrou duas regiões de síntese de diferentes proteínas. Foram realizados testes de atividade antimicrobiana utilizando o pool catiônico após troca aniônica e o pico eluído com 0,35 M de NaCl após troca catiônica, para as bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum (gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (gram- positiva), mostrando inibição parcial e total para os extratos após troca aniônica e catiônica, respectivamente. Paralelamente, análises de espectrometria de massa com os extratos obtidos após RP-HPLC indicaram a presença de peptídio de 1 a 9 kDa e de proteína de massa maior que 20 kDa, em regiões do perfil cromatográfico correspondentes à eluição em concentrações inferiores e superiores a 40% de acetonitrila, respectivamente. Outros picos peptídicos sintetizados durante a germinação por 48, estão sendo submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídios efetivos contra fitopatógenos de interesse.Item Prospecção de peptídeos antimicrobianos de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas(Universidade Federal de Viçosa, 2008-09-26) Barbosa, Meire de Oliveira; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4760294D3; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Santoro, Marcelo Matos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/index.jsp; Prates, Maura Vianna; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795647J7Técnicas baseadas em separações por cromatografia líquida bidimensional (TDLC) ou multidimensional (MDLC), acopladas à espectrometria de massa (MS), têm sido utilizadas nas separações de proteínas e de peptídeos para estudos de bioprospecção de atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi a prospecção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas. Extratos de sementes de soja não germinadas (SSNG) e de sementes de soja germinadas por 48 horas (SSG48) foram submetidos ao fracionamento salino, aquecimento seletivo, diálise, cromatografia de troca aniônica (CTI) e de fase reversa (C18 RP-HPLC), seguindo-se análises de MS. Comparações dos perfis cromatográficos (CTI e RP- HPLC) de SSNG e SSG48 sugeriram que diferentes peptídeos estão sendo sintetizados, já que massas moleculares (MM) menores que 10 kDa foram identificadas por MS. Ensaio de biorrevelação com a fração catiônica das SSG48 mostrou que compostos com MM abaixo de 14 kDa foram capazes de inibir o crescimento da bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. Assim, objetivando conhecer melhor as características do conjunto de AMPs de SSG48, foram avaliadas diferentes metodologias utilizando diferentes técnicas de clareamento e de purificação, e um novo protocolo para a prospecção de peptídeos foi proposto, contendo as seguintes etapas: extração, fracionamento com sulfato de amônio (35-75% sat.), ultrafiltração (membranas com volume de exclusão de 30 e 1 kDa), TDLC (cromatografia de exclusão molecular - CEM e C18 RP-HPLC). As frações obtidas após a C18 RP-HPLC foram aquecidas à ebulição para a remoção dos solventes e utilizadas para ensaios de atividade antimicrobiana, SDSTricina- PAGE e MS. Diferentes frações eluídas da C18 RP-HPLC, após o aquecimento, foram ativas contra cinco bactérias fitopatogênicas, tendo sido identificadas MM inferiores a 10 kDa nessas frações. A avaliação da síntese ou da expressão diferencial de AMPs em SSNG e SSG48 evidenciou que SSG48 apresenta um potencial para a identificação de peptídeos de grande importância funcional, possivelmente envolvidos nos processos de defesa. O ajuste de protocolo permitiu um enriquecimento das amostras em AMPs em SSG48, resistentes à alta temperatura e ao contato com acetonitrila e TFA, ainda não descritos, podendo essas características ser exploradas para aplicação biotecnológica na agroindústria. Paralelamente, utilizando ferramentas de bioinformática, foram realizadas buscas em banco de dados (NCBI) visando à identificação de seqüências de DNA que codificam para AMPs em soja. Uma seqüência de uma provável defensina foi obtida e clonada em Escherichia coli. O plasmídeo de expressão (pPIC 9) contendo a defensina foi linearizado e utilizado para a transformação de Pichia pastoris, um transformante His+ foi utilizado para avaliar a expressão da defensina recombinante, e SDS-Tricina-PAGE para verificar a expressão. A avaliação por SDS-Tricina-PAGE não permitiu confirmar a expressão da defensina até o momento, sob as condições utilizadas. A identificação e clonagem de uma possível defensina foram realizadas com sucesso, e sua expressão vem sendo buscada, o que provavelmente possibilitará sua caracterização para aplicações biotecnológicas diversas.