Biologia Celular e Estrutural
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Item Construção de um sistema de expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em Nicotiana tabacum "Havana" e análise da expressão do transgene(Universidade Federal de Viçosa, 2009-12-15) Amaro, Marilane de Oliveira Fani; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; http://lattes.cnpq.br/8475779445932134; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0A dengue é a doença mais importante causada por arbovírus no mundo, sendo observado nos últimos vinte anos um aumento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica, transmissão contínua de vários sorotipos e emergência da Febre hemorrágica (DHF) em áreas onde a doença não era prevalente. Apesar dos processos metodológicos de diagnóstico da dengue estar na atualidade em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho na realização de testes diagnósticos para dengue reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura do anticorpo presente no soro de pacientes infectados. Devido a este fator, o objetivo é a obtenção de antígeno em grandequantidade e qualidade utilizando um sistema de expressão heteróloga de proteínas em plantas. Para tanto, foi extraído o RNA total do sobrenadante de cultura de células infectadas e a partir deste foi sintetizado o cDNA. O gene da proteína não estrutural (NS1) do sorotipo dengue 2 foi obtido através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), separado por eletroforese e purificado. O gene foi, então, clonado em vetores pGEM-T e pCAMBIA. Bactérias Escherichia coli DH5α foram transformadas, selecionadas em meio seletivo e estocadas a -80º C. O vetor pCAMBIA foi anteriormente clivado com as mesmas enzimas e o gene da proteína NS1 foi ligado a este por enzima T4 ligase. Nova transformação de E. coli DH5α foi realizada e as colônias foram, então, analisadas quanto a presença do gene que codifica a proteína NS1 através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). As colônias transformantes recombinantes foram selecionadas e estocadas. Este vetor recombinante, pCAMBIA 3301/NS1, foi utilizado para transformação de Agrobacterium tumefaciens e, posteriormente, de Nicotiana tabacum para expressão da proteína não-estrutural NS1. A extração do DNA e do RNA proveniente das plantas do tabaco foi realizada. A integração do gene da proteína NS1 no genoma vegetal e sua transcrição foram confirmadas por PCR. Análises subsequentes serão realizadas para verificar a expressão efetiva da mesma, que será purificada e concentrada.Item Expressão heteróloga da proteína não estrutural (NS1) do vírus dengue-2 visando a produção de antígenos para kits diagnósticos(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-26) Amaro, Marilane de Oliveira Fani; Cardoso, Silvia Almeida; http://lattes.cnpq.br/6041368188542057; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; http://lattes.cnpq.br/8475779445932134; Siqueira-batista, Rodrigo; http://lattes.cnpq.br/7992589011048146; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Eller, Monique Renon; http://lattes.cnpq.br/4821785523906789; Paiva, Aline Dias; http://lattes.cnpq.br/6496294850014934A dengue é uma das doenças mais importantes causada por arbovírus no mundo, sendo observado nos últimos vinte anos um aumento significativo na distribuição geográfica, transmissão contínua de vários sorotipos e emergência da Febre hemorrágica em áreas onde a doença não era prevalente. Apesar dos processos metodológicos de diagnóstico da dengue estarem na atualidade em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho para a realização de testes diagnósticos para dengue reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem utilizados em testes diagnósticos. Devido a esta demanda, os objetivos deste trabalho foram a obtenção da proteína não estrutural 1(NS1) do sorotipo dengue 2, através da expressão heteróloga em Nicotiana tabacum e a construção de um vetor otimizado para expressão em plantas com o intuito de elevar os níveis de expressão da proteína recombinante nas plantas transgênicas e facilitar sua purificação. Após a confirmação da expressão em Nicotina tabacum, a proteína heteróloga foi caracterizada por imunoblot. Em ensaio imunoenzimático a proteína NS1 recombinante, apresentou potencial como antígeno para desenvolvimento de Kits de diagnóstico da dengue e foi confirmado a transformação de Agrobacterium tumefaciens com o vetor otimizado. Estudos posteriores verificarão a expressão da proteína NS1 recombinante em Arabidopsis thaliana e sua potencial utilização em Kits diagnósticos.