Avaliação do silenciamento de SRPK por CRISPR/Cas9 e da interação com EFHD2 em melanoma metastático murino

Abstract

As proteínas cinases serina/arginina (SRPK) são classicamente relacionadas à regulação do splicing do pré-mRNA pela fosforilação de fatores de splicing ricos em dipeptídeos serina e arginina, as proteínas SR. É evidente a importância de estudos que visem elucidar os mecanismos moleculares da atuação das SRPK em diversas vias de sinalização, splicing do pré-mRNA e outros processos celulares, sobretudo relacionados ao desenvolvimento do câncer e formação de metástase, nos quais essas cinases já foram identificadas superexpressas. Neste trabalho, avaliamos o impacto do silenciamento de SRPK em melanoma metastático murino. O silenciamento de SRPK2 na linhagem celular de melanoma, B16F10, prejudicou o desenvolvimento do tumor subcutâneo e a formação de nódulos pulmonares in vivo e diminuiu a proliferação e a invasão celular in vitro. A supressão da expressão de SRPK1 e SRPK2, simultaneamente, diminuiu a capacidade de formação de colônias de B16F10. O mecanismo de ação de SRPK2 no desenvolvimento do melanoma parece estar relacionado à sua atuação na dinâmica de polimerização do citoesqueleto de Actina, pois o silenciamento de SRPK2 diminuiu a formação de F-actina nas células B16F10. Um ensaio de duplo-híbrido em leveduras, realizado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa, mostrou a possível interação entre a região espaçadora de SRPK2 e proteínas relacionadas à regulação do citoesqueleto de Actina. Dentre elas, EFhd2 está envolvida na regulação da dinâmica de polimerização do citoesqueleto de actina e formação de metástase em melanoma. Neste trabalho a interação entre SRPK2 e EFhd2 foi confirmada pelos ensaios de co-imunoprecipitação e GST-pulldown. Ensaios de fosforilação in vitro mostraram que EFhd2 pode ser fosforilada por SRPK2. Portanto, com os resultados obtidos até o momento, é possível sugerir que a diminuição da capacidade metastática de B16F10 em decorrência da supressão da expressão de SRPK2 pode envolver, pelo menos parcialmente, alterações na dinâmica do citoesqueleto de Actina via EFhd2. Esses dados criam novas perspectivas sobre o entendimento da relação funcional entre SRPK2 e a dinâmica do citoesqueleto de Actina no contexto do melanoma metastático e potencialmente em outros tipos de tumores. Palavras-chave: Serine/arginine protein kinase. Melanoma. Metástase.Serine/arginine protein kinases (SRPK) are involved in the regulation of pre-mRNA splicing by the phosphorylation of splicing factors rich in serine and arginine dipeptides (SR proteins). It is clear the importance of studies that aim to elucidate the molecular mechanisms of SRPK action in several signaling pathways, pre-mRNA splicing and other cellular processes. This is especially related to the development of cancer and metastasis formation, in which these overexpressed kinases have already been identified. In this study, we evaluated the effect of SRPK silencing on murine metastatic melanoma. The silencing of SRPK2 in the melanoma cell line B16F10 impaired the development of a subcutaneous tumor and the formation of pulmonary nodules in vivo and decreased the proliferation and the cell invasion in vitro. The simultaneous suppression of the expression of SRPK1 and SRPK2 decreased the colony- forming ability of B16F10 cells. The mechanism of action of SRPK2 in the development of melanoma seems to be related to its role in the polymerization of the Actin cytoskeleton, since the silencing of SRPK2 decreased the formation of F-actin in B16F10 cells. A yeast two- hybrid assay previously performed by our research group showed a possible interaction between the SRPK2 spacer region and some proteins related to the regulation of the Actin cytoskeleton. Among the proteins found, EFhd2 is involved in the regulation of the polymerization dynamics of the Actin cytoskeleton and in the formation of metastases in melanoma. In this study, the interaction between SRPK2 and EFhd2 was confirmed by performing co-immunoprecipitation and GST pull-down assays. In vitro phosphorylation assays have demonstrated that EFhd2 can be phosphorylated by SRPK2. Therefore, from the results obtained so far, it is possible to suggest that the decrease in the metastatic ability of B16F10 cells due to the suppression of SRPK2 expression, may involve at least partially, changes to the dynamics of the Actin cytoskeleton via EFhd2. These data create new perspectives on the understanding of the functional relationship between SRPK2 and the dynamics of the Actin cytoskeleton in the context of metastatic melanoma and potentially in other types of tumors. Keywords: Serine/arginine protein kinase. Melanoma. Metastasis.