Effect of bioengineered nisin on Staphylococcus aureus cells and biofilm
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Data
2019-02-22
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Universidade Federal de Viçosa
Resumo
Nisin is the most studied lantibiotic, used as a food preservative all around the world, and its structure is composed of five lanthionine rings (A, B, C, D and E). This peptide is characterized by a dual mode of action, consisting of the inhibition of cell wall biosynthesis and the formation of pores in the bacterial cell membrane, due to its ability to interact with the target molecule, lipid II. Due its structure and its gene encoding nature, nisin can be used by bioengineering to generate new derivatives with improved antimicrobial activity. In this study, the molecular structure of nisin A and three derivatives N20P, S29A and M21V were characterized in silico and the antimicrobial effect on S. aureus cells was validated by experimental methods. Sequentially, the antimicrobial activity of nisin A and its derivatives was evaluated against the S. aureus biofilm by detection of the biomass content and metabolic activity using the violet crystal test and 2,3-bis[2- methyloxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), respectively. The results obtained by in silico analysis showed that the point mutations caused steric alterations in the nisin molecule, become it more planar, and possibly facilitating the molecular interactions of the C, D and E rings involved in the formation of pores. Cell leakage assays showed greater loss of NADPH and ATP over a short period of time from nisin treated cells. Modifications in the cytoplasmic membrane were observed by analysis of atomic force microscopy. Changes in position 21 of the nisin molecule may result in a peptide with higher activity and greater interaction with membrane molecules, facilitating the formation of pores and promoting greater loss of intracellular ATP. The N20P, S29A and M21V derivatives of nisin A presented greater capacity to inactivate the S. aureus biofilm, both by the removal of cells and inactivation of the sessile cells. The influence of the dltA and mprF genes, which are involved in the cationic peptide resistance mechanism, such as nisin, was also evaluated using the S. aureus ΔdltA and ΔmprF mutants. The deletion of the dltA and xmprF genes did not alter the ability of these strains to form a biofilm, but it made the action of more sensitive to bacteriocins. The results showed the increased antibiofilm potential of modified nisin and suggest that improvement by bioengineering techniques may be a strategy to produce a better antimicrobial to control growth and to remove S. aureus biofilm
Nisina é o lantibiótico mais estudado e usado como conservante de alimentos em todo o mundo, sendo sua estrutura molecular composta por cinco anéis de lantionina (A, B, C, D e E). Este peptídeo é caracterizado por um modo duplo de ação, consistindo da inibição da biossíntese da parede celular e a formação de poros na membrana celular bacteriana, devido a sua capacidade de interagir com a molécula alvo, o lipídio II. Em razão da estrutura da nisina e da sua natureza codificada por genes, técnicas de bioengenharia podem ser usadas para gerar novos derivados, com atividade antimicrobiana melhorada. Neste estudo, nisina A e três derivados denominados de N20P, S29A e M21V foram caracterizados, in silico, quanto à estrutura molecular e o efeito antimicrobiano foi validado por métodos experimentais sobre células de S. aureus. Posteriormente, a atividade antimicrobiana de nisina A e de seus derivados foi avaliada contra o biofilme de S. aureus pela detecção do conteúdo de biomassa e atividade metabólica, utilizando o teste de cristal violeta e 2,3-bis[2-methyloxy-4- nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), respectivamente. Os resultados obtidos por análises in silico mostraram que as mutações pontuais causaram modificações estéricas na molécula de nisina, deixando-a mais plana e possivelmente, facilitando melhor ajuste dos anéis C, D e E, envolvidos na formação de poros. Os ensaios de extravasamento de conteúdo celular mostraram maior perda de NADPH e ATP em um curto período de tempo a partir de células tratadas com nisina. Modificações na membrana citoplasmática foram observadas por análise de microscopia de força atômica. Alterações na posição 21 da molécula de nisina podem resultar em um peptídeo com maior atividade e maior interação com moléculas de membrana, facilitando a formação de poros e promovendo maior perda de ATP intracelular. Os derivados N20P, S29A e M21V de nisina A apresentaram maior capacidade de inativar o biofilme de S. aureus, tanto pela remoção de células, quanto pela inativação das células sésseis. A influência dos genes dltA e mprF, que estão envolvidos no mecanismo de resistência a peptídeos catiônicos, como a nisina, também foi avaliada usando os mutantes de S. aureus ∆dltA e ∆mprF. A deleção dos genes dltA e mprF não alterou a capacidade dessas linhagens de formar biofilme, entretanto, ficaram mais sensíveis à ação das bacteriocinas. Os resultados mostraram o aumento do potencial antibiofilme da nisina modificada e sugerem que a melhoria, por técnicas de bioengenharia, pode ser uma estratégia para produzir um antimicrobiano mais efetivo para controlar o crescimento e remover o biofilme de S. aureus
Nisina é o lantibiótico mais estudado e usado como conservante de alimentos em todo o mundo, sendo sua estrutura molecular composta por cinco anéis de lantionina (A, B, C, D e E). Este peptídeo é caracterizado por um modo duplo de ação, consistindo da inibição da biossíntese da parede celular e a formação de poros na membrana celular bacteriana, devido a sua capacidade de interagir com a molécula alvo, o lipídio II. Em razão da estrutura da nisina e da sua natureza codificada por genes, técnicas de bioengenharia podem ser usadas para gerar novos derivados, com atividade antimicrobiana melhorada. Neste estudo, nisina A e três derivados denominados de N20P, S29A e M21V foram caracterizados, in silico, quanto à estrutura molecular e o efeito antimicrobiano foi validado por métodos experimentais sobre células de S. aureus. Posteriormente, a atividade antimicrobiana de nisina A e de seus derivados foi avaliada contra o biofilme de S. aureus pela detecção do conteúdo de biomassa e atividade metabólica, utilizando o teste de cristal violeta e 2,3-bis[2-methyloxy-4- nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), respectivamente. Os resultados obtidos por análises in silico mostraram que as mutações pontuais causaram modificações estéricas na molécula de nisina, deixando-a mais plana e possivelmente, facilitando melhor ajuste dos anéis C, D e E, envolvidos na formação de poros. Os ensaios de extravasamento de conteúdo celular mostraram maior perda de NADPH e ATP em um curto período de tempo a partir de células tratadas com nisina. Modificações na membrana citoplasmática foram observadas por análise de microscopia de força atômica. Alterações na posição 21 da molécula de nisina podem resultar em um peptídeo com maior atividade e maior interação com moléculas de membrana, facilitando a formação de poros e promovendo maior perda de ATP intracelular. Os derivados N20P, S29A e M21V de nisina A apresentaram maior capacidade de inativar o biofilme de S. aureus, tanto pela remoção de células, quanto pela inativação das células sésseis. A influência dos genes dltA e mprF, que estão envolvidos no mecanismo de resistência a peptídeos catiônicos, como a nisina, também foi avaliada usando os mutantes de S. aureus ∆dltA e ∆mprF. A deleção dos genes dltA e mprF não alterou a capacidade dessas linhagens de formar biofilme, entretanto, ficaram mais sensíveis à ação das bacteriocinas. Os resultados mostraram o aumento do potencial antibiofilme da nisina modificada e sugerem que a melhoria, por técnicas de bioengenharia, pode ser uma estratégia para produzir um antimicrobiano mais efetivo para controlar o crescimento e remover o biofilme de S. aureus
Descrição
Palavras-chave
Peptídeos, Nisina, Agentes antiinfeccioso
Citação
ANDRE, Cleriane. Effect of bioengineered nisin on Staphylococcus aureus cells and biofilm. 2019.53 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2019.