A função do chaperone molecular BiP na resposta a estresses abióticos

Abstract

A manutenção da homeostase em organismos vivos passa por mecanismos de percepção e propagação dos mais diversos sinais dentro da célula e do organismo como um todo por meio de complexas redes de sinalização.Vias de sinalização em planta possuem, muitas vezes, o papel de minimizar os efeitos deletérios de estresses bióticos e abióticos,por meio da ativação e repressão de genes específicos. Estes estresses são responsáveis por prejudicar o desenvolvimento e levar a perdas na produção. Desta maneira, diferentes estudos têm focadoem elucidar estasvias de sinalização com a finalidade de obter cultivares superiores. Dentre estas, a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e a via mediada por proteínas ricas em asparaginas (NRPs), que transduzem sinais de morte celular originados de estresse no retículo endoplasmático (RE) e osmótico, exercem um papel de atenuação dos estresses e alterações relacionadas ao desenvolvimento. A chaperona molecular residente do RE, BiP, foi demonstrada retardar a indução de morte celular em condições de estresse ea senescência natural,regulando, assim, ambas as vias de sinalização. No entanto, o mecanismo pelo qual BiP controla estas vias é totalmente desconhecido. Desta forma, osobjetivos do presente trabalho foram(I) avaliar o papel do domínio ATPase e da atividade chaperona de BiP no processo de modulação das vias de resposta a estresses no RE, osmótico e de morte celular programada (II) Identificar possíveis candidatos moduladores supressores do mecanismo de tolerância à seca mediado por BiP. Foram geradas mutações no gene de BiPD no sítio de hidrólise do ATP (T44G) e no sítio de ligação ao ATP (G233D), com o propósito de demonstrar se a região chaperona de BiP influência na sua modulação das vias de sinalização. A partir destes mutantes, diferentes técnicas foram utilizadas para demonstrar que estas mutações levaram à perda de função de BiP. Experimentos de estresse hídrico foram realizados demonstrando que as plantas transformadas com o gene mutado ficaram mais susceptíveis à morte celular. Através do tratamento com tunicamicina (indutor de estresse no RE), o nível de expressão de genes da UPR aumentou nas plantas BiPD-T44G e BiPD-G233D, além do fenótipo de morte celular ter sido mais agravante comprovado pelo experimento de Azul de Evans e de infiltração. Além disso, o comportamento da indução de genes NRPs foi alterado nestas plantas, uma vez que houve um aumento da indução destes genes quando comparados com a planta superexpressando BiP. Os resultados obtidos indicam que a função chaperone de BiP está relacionada com a forma que BiP atua em resposta a estresse hídrico e estresse no RE. De forma a identificar possíveis moduladores do mecanismo de tolerância mediado por BiP, foram realizadas mutações com EMS em plantas superexpressando BiPD, e por meio do sequenciamento do genoma das mesmas foram selecionados possíveis supressores do mecanismo de tolerância à seca de BiP. Dentre os genes identificados, ZAR1 foi selecionado para estudo.Primeiramente foi demonstrado que ZAR1 apresenta expressão aumentada em plantas superexpressando BiPD. Além disso, foram obtidas plantas superexpressando e silenciadas para o gene ZAR1. Ensaio de infiltração de tunicamicina em Arabidopsisthalianamostrou que plantas superexpressando ZAR1 apresentam menor grau de clorose decorrente do processo de morte celular, enquanto que em plantas knock-down para ZAR1 este processo foi acelerado. Estudos mostraram que o regulador de proteína G, RGS1, possui função de dessensibilizar a sinalização mediada por proteína G, além de estar envolvido na regulação em resposta à seca. Este mecanismo ainda não é totalmente conhecido, entretanto foi identificado queproteínas LRRRLK são responsáveispela fosforilação de RGS1 ativando sua modulação das proteínas G. ZAR1 possui sítio de ligação à proteína G e pertence à família das LRRRLK, desta maneira ensaio de co-imunoprecipitação e ensaio de complementação de fluorescência bimolecular foram realizados e, a interação entre ZAR1 e RGS1 foi provada.No entanto, posteriores estudos precisam ser realizados para identificar o mecanismo envolvido nesta interação, além de qual resposta é desencadeada após essa interação. Estes resultados indicam uma correlação direta entre ZAR1 e morte celular induzida por tunicamicina e apontam favoravelmente para um envolvimento direto de ZAR1 como supressor do mecanismo de ação de BiP.The maintenance of homeostasis in living organisms involves a mechanism of perception and propagation of the most diverse signals within the cell and the organism as a whole through complex signaling networks. Signaling pathways in plants often have the role of minimizing the deleterious effects of biotic and abiotic stresses by activating and repressing specific genes. These stresses are responsible for impairing the development of plants leading to losses in production. In this way, different studies have focused on elucidating these signaling pathways in order to obtain superior cultivars. Among these, the pathway to unfolded proteins response (UPR) and the asparagine-rich proteins (NRPs)-mediated pathway, which transduce signs of cell death originating from stress in the endoplasmic and osmotic reticulum, exert a role of attenuation of the stresses and changes. The resident molecular chaperone of RE, BiP, has been shown to delays the induction of cell death under stress conditions and natural senescence, thereby regulating both signaling pathways. However, the mechanism by which BiP controls such pathways is totally unknown.Therefore,the objectives of the present work were (I) to evaluate the role of the ATPase domain and the chaperone activity of BiP in the process of modulating the stress response pathways in the ER, osmotic and programmed cell death (II) to identify possible candidate suppressor modulators of the BiP-mediated drought tolerance mechanism. BiPD gene specific mutations were generated at the ATP hydrolysis site (T44G) and at the ATP binding site (G233D), in order to demonstrate whether the BiP chaperone region influences its modulation of the signaling pathways. From these mutants, different techniques were used to demonstrate that such mutations led to loss of BiP function. Water stress experiment was performed demonstrating that the transgenic plants carrying the mutated gene were more susceptible to cell death. Through the treatment with tunicamycin (stress inducitor in RE), the level of UPR gene expression increased in the BiPD-T44G and BiPD-G233D plants, and the cell death phenotype was more aggravated by the Evans Blue experiment and the infiltration. In addition, the behavior of the induction of NRPs genes was altered in these mutated plants, since there was an increased induction of these genes when compared to the plant overexpressing BiP. The results indicate that the chaperone function of BiP is related to the way that BiP acts in response to water stress and RE stress. In order to identify possible modulators of the mechanism of tolerance mediated by BiP, mutations with EMS were performed in BiPD overexpressing plants, and through the sequencing of the genome were selected possible suppressors of the mechanism of tolerance to drought of BiP. Among the identified genes ZAR1 was selected for study. First, ZAR1 gene has been shown up-regulate in BiPD overexpressing line. Moreover, ZAR1 overexpressing and silencing lines were obtained. Tunicamycin infiltration in Arabidopsis thaliana showed that ZAR1 overexpressing lines showed a lower chlorosis level due to the cell death process, whereas in ZAR1 knock-down plants this process was accelerated. Studies have shown that the G protein regulator, RGS1, has the function of desensitizing the G protein- mediated signaling, besides being involved in regulation in response to drought. This mechanism is not yet fully understood, however it is showed that LRRRLK proteins are responsible for the phosphorylation of RGS1 activating its G protein modulation. ZAR1 has a G protein binding site and belongs to the LRRRLK family, in this way co- immunoprecipitation assay and bimolecular fluorescence complementation assay were performed and the interaction between ZAR1 and RGS1 was proved. However, further studies are necessary to identify the mechanism involved in this interaction, in addition to which response is triggered after this interaction. These results indicate a direct correlation between ZAR1 and tunicamycin-induced cell death and favorably point to a direct involvement of ZAR1 as a suppressor of the BiP action mechanism.