Padronização da expressão da Serine Arginine Protein Kinase de Leishmania braziliensis (LbSRPK)

Abstract

Leishmanioses são um conjunto de doenças que afetam severamente diversos países pelo mundo, principalmente países tropicais subdesenvolvidos, tendo a sua transmissão por meio de insetos flebotomíneos a partir de indivíduos infectados. Tal doença possui diferentes formas de manifestação, sendo as principais a Leishmaniose tegumentar, causada no Brasil pela Leishmania braziliensis, e visceral, que é potencialmente fatal se não houver intervenção médica. No entanto, mesmo os tratamentos mais avançados ainda não são totalmente eficientes, de modo que a doença ainda não possui cura. As principais intervenções que são feitas atualmente utilizam-se de diferentes medicamentos que além da baixa eficácia, são de administração parenteral, de uso restrito e podem levar à reações adversas nos pacientes, que muitas vezes abandonam do tratamento, podendo até mesmo criar resistência por parte do parasito. Tendo isso em vista, há uma urgência cada vez maior no desenvolvimento de formas mais eficazes de intervenção à Leishmaniose e uma das apostas promissoras é na utilização da proteína Serine Arginine Protein Kinase (SRPK) recombinante como um alvo farmacológico para os tratamentos. Esta proteína já tem sido utilizada em alguns estudos que utilizam-na como alvo farmacológico no tratamento de outras doenças infecciosas como câncer, degeneração macular, doenças virais e outras mais. Isso se deve ao fato das SRPK’s estarem envolvidas em processos importantes do ciclo celular, atuando em proteínas que controlam os processos de splicing e splicing alternativo, ou trans-splicing, no caso de tripanossomatídeos. Diante disso, para que seja possível estudar estas proteínas, realizamos a indução da expressão heteróloga, um procedimento amplamente utilizado para obtenção de proteínas recombinantes. Neste processo, diversos fatores envolvidos na indução da expressão das proteínas precisam ser otimizados para que a expressão seja eficiente, uma vez que estes fatores podem afetar tanto a expressão, como a solubilidade das proteínas, tendo em vista que buscamos expressá-las na fração solúvel para preservar a sua atividade biológica. Diante disso, neste trabalho foi realizada a padronização da condições de expressão da SRPK de Leishmania braziliensis (LbSRPK) em cepas de BL21 (DE3) de Escherichia coli utilizando o pET28a como vetor de expressão e isopropil β-D -1 tiogalactopiranosídeo (IPTG) como indutor, onde foram testadas diferentes condições de indução com a finalidade de se ter uma maior quantidade da proteína expressa na fração solúvel. Foi testado o impacto de diversos fatores na solubilidade da proteína, dentre eles: temperatura (37°C, 30°C e 20°C), concentração do indutor (0,1mM e 0,25mM), agitação dos frascos (180 rpm e 90 rpm) e tempo de indução (3h, 4h, 5h, 6h, 18h). Os resultados apontaram diferenças consideráveis na expressão das proteínas nas diversas condições de indução avaliadas, de modo que a indução com maior expressão da proteína na fração solúvel foi utilizando 20°C de temperatura, 180 rotações por minuto dos frascos de 50 mL de meio LB contendo as células transformadas, uma concentração baixa de 0,1mM de IPTG por um período de 18 horas de indução. Além disso, análises de bioinformática da filogenética da SRPK de Leishmania spp. e de outros organismo, sobretudo seres humanos, sugerem que as semelhanças entre as SRPK’s destes organismo podem estar ligadas a funções críticas da proteína enquanto as diferenças entre elas, decorrentes da adaptação dos organismos e que podem ser exploradas na atuação dos fármacos, podem influenciar as interações com outros componentes celulares ou na regulação da atividade da proteína. Além disso, a alta semelhança entre as SRPK’s de mamíferos apoiam a utilização de camundongos nos testes iniciais dos fármacos antes de se testar em seres humanos ou animais domésticos. A partir disso, este trabalho realizou a padronização das condições de indução destas expressões da LbSRPK, a fim de observar as melhores condições para a obtenção das proteínas na fração solúvel e assim servir de referência para futuras induções em maiores escalas da LbSRPK, possibilitando então o estudo aprofundado desta proteína.Leishmaniasis is a group of diseases that severely affects many countries worldwide, particularly in underdeveloped tropical regions. Transmitted by sand flies from infected individuals, these diseases manifest in various forms, with the most common being cutaneous leishmaniasis, caused by Leishmania braziliensis in Brazil, and visceral leishmaniasis, which can be fatal without medical intervention. Despite advanced treatments, a cure remains elusive. Current interventions rely on various drugs that, in addition to having low efficacy, are administered parenterally, have limited availability, and can cause adverse reactions, often leading patients to discontinue treatment and potentially promoting drug resistance in the parasite. Given this, there is a pressing need for more effective interventions against leishmaniasis. One promising approach is targeting recombinant serine/arginine protein kinase (SRPK) as a pharmacological strategy. SRPKs have been investigated as targets in other diseases such as cancer, macular degeneration, and viral infections due to their involvement in essential cellular processes, including splicing and alternative splicing. To study these proteins, we used heterologous expression, a widely adopted method for obtaining recombinant proteins. This process involves optimizing various factors to achieve efficient expression and solubility, as our goal was to express the protein in the soluble fraction to preserve its biological activity. In this study, we standardized the expression conditions of Leishmania braziliensis SRPK (LbSRPK) in Escherichia coli BL21 (DE3) using the pET28a expression vector and isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) as an inducer. We tested different induction conditions to maximize soluble protein expression. Various factors were evaluated for their impact on protein solubility, including temperature, inducer concentration, agitation rate, and induction time. The results showed significant differences in protein expression under the conditions tested. Optimal expression in the soluble fraction was achieved at 20°C, 180 rpm, in 50 mL of LB medium containing transformed cells, with a low IPTG concentration of 0.1 mM for an 18-hour induction period. Furthermore, bioinformatic analyses of the phylogeny of Leishmania spp. SRPKs and other organisms, particularly humans, suggest that similarities between SRPKs may be linked to critical protein functions, while differences due to organismal adaptation could be exploited for drug targeting. The high similarity between mammalian SRPKs supports the use of mice for initial drug testing before proceeding to trials in humans or domestic animals. In conclusion, this study standardized the induction conditions for LbSRPK expression, identifying optimal conditions for obtaining the protein in the soluble fraction. These findings provide a foundation for future large-scale inductions of LbSRPK, enabling more detailed studies of this protein.