Estudo bioquímico, biológico e busca por inibidores da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase-2 (LicNTPDase-2) de Leishmania infantum chagasi como estratégia para o desenho racional de drogas

Abstract

A leishmaniose visceral é uma doença grave, responsável por cerca de 57 mil mortes por ano em todo o mundo. Os parasitos do gênero Leishmania se mostram incapazes de sintetizar purinas, e acredita-se que as nucleotideo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) participem desse processo, e até mesmo o sistema imune, pela hidrólise de nucleotídeos extracelulares. Neste trabalho a NTPDase de Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-2) foi estudada. A enzima mostrou uma utilização de nucleotídeos tri e difosfatados na presença de cálcio ou magnésio (GTP > GDP = UDP > ADP > UTP = ATP). A enzima também mostrou-se ativa em uma ampla faixa de pH (6,0 a 9,0) e foi inibida parcialmente por ARL67156 e suramina. A análise microscópica revelou a presença da enzima na superfície celular em diversas organelas e foi capaz de diminuir a infecção em macrófagos. Também foi avaliado a importância da padronização da renaturação de enzimas purificadas a partir de corpos de inclusão. A renaturação da LicNTPDase-2 em tampão otimizado foi capaz de aumentar a atividade enzimática em até dezesseis vezes. Devido a importância do desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da leishmaniose visceral, foi feita a busca por inibidores. Alguns compostos, como as isobenzofuranonas WLP8 e WLP9, mesmo não sendo inibidores da LicNTPDase- 2, foram capazes de diminuir a viabilidade celular dos promastigotas de L. infantum chagasi sem afetar o crescimento de macrófagos, na concentração de 75 M. Mais estudos são necessários sobre, mas os trabalhos mostram a importância da enzima para o parasito e destaca novos compostos com potenciais para fármacos.

Visceral leishmaniasis is a serious disease, responsible for about 57000 deaths per year worldwide. Parasites of the genus Leishmania are unable to synthesize purines, and it is believed that the nucleotide triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) are involved in this process, and even in the immune system by hydrolysis of extracellular nucleotides. In this work, the Leishmania infantum chagasi NTPDase-2 (LicNTPDase-2) was studied. The enzyme hydrolysed tri- and diphosphate nucleotides in the presence of calcium or magnesium (GTP> UDP GDP => ADP> ATP = UTP). The enzyme also proved to be active in a broad pH range (6.0 to 9.0) and was partially inhibited by suramin and ARL67156. Microscopic analysis revealed the presence of the enzyme at the cell surface and various organelles and was able to reduce the infection in macrophages. We also assessed the importance of standardization of the renaturation step of enzymes obtained from inclusion bodies. Renaturation of LicNTPDase-2 in na optimized buffer was able to enhance the enzymatic activity up to sixteen times. Due to the importance of developing new drugs for the treatment of visceral leishmaniasis, we searched for inhibitors of LicNTPDase-2. Some compounds, such as the isobenzofuranones WLP8 and WLP9, although not LicNTPDase-2 inhibitors, were able to reduce cell viability of L. infantum chagasi promastigotes without affecting the growth of macrophages at a concentration of 75 M. Further research is needed, but the presented studies show the importance of this enzyme to the parasite and highlights new compounds for potential drugs.