Protoplast production and isolation from Etlingera elatior

Abstract

The technique of hybridization using plant protoplasts is widely used in plant breeding programs. The purpose of our study is to further characterize the process of protoplast isolation from the ornamental species Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith. Protoplasts were isolated from different tissues: in vitro leaves, in vitro pseudostem, and leaves from plants cultivated hydroponically. We tested six enzymatic combinations, four incubation time periods, the rotary system (40 rpm) or steady in the dark, and three concentrations of mannitol (0.5, 0.6 and 0.7 M). The diameter and viability of obtained protoplasts were evaluated. The best source of explants used for protoplast isolation was the in vitro leaves, which yielded 22x105 protoplasts g-1 of fresh matter. The optimal incubation period was 15 hours. The in vitro leaves presented a greater viability (96%) and larger protoplasts (36.7 µm diameter). Greater yields were obtained using a rotatory system with protoplasts incubated in the dark. The best enzymatic combination was 3% Cellulase Onozuca R-10 + 2% Meicelase + 1% Driselase + 1% Dextran + 5 mM MES, followed by the addition of 0.6 M mannitol.

Com o objetivo de realizar hibridações que auxiliam em programas de melhoramento genético de flores ornamentais, protoplastos foram isolados a partir de diferentes tecidos (folhas in vitro, pseudocaules in vitro e folhas em sistema hidropônico) de Etlnigera elatior (Jack) R. M. Smith. Foram testados seis diferentes combinações enzimáticas, quatro períodos de incubação, sistema rotatório (40 rpm) ou estacionário no escuro, concentrações de manitol (0,5; 0,6 e 0,7 M), o diâmetro e a viabilidade dos protoplastos isolados. A melhor fonte de explante utilizado no isolamento de protoplastos foi folha in vitro, com rendimento de 22 x105 protoplastos g-1 MF. O melhor tempo de incubação foi 15 horas, pois períodos superiores a este causavam diminuição no rendimento e viabilidade dos protoplastos. Protoplastos de folhas in vitro apresentaram viabilidade de 96% e diâmetro de 36,7 µm. Maiores rendimentos foram alcançados em sistema rotatório e no escuro. A melhor combinação enzimática utilizada no atual trabalho foi a 3% Cellulase Onozuka R-10 + 2% Meicelase + 1% Driselase + 1% Dextran + 5 mM MES. A melhor concentração de manitol foi de 0,6 M.