Edição de genes de resistência dominante e recessiva contra begomovirus

Abstract

Begomovirus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, uma das maiores famílias de vírus de plantas, cujas espécies infectam diversas monocotiledôneas e dicotiledôneas cultiváveis e representam severa limitações à produtividade agrícola mundialmente. Esse amplo espectro de gama de hospedeiros resulta de estratégias sofisticadas desenvolvidas por geminivírus para superar o arsenal de defesas antivirais em espécies de plantas tão diversas. Portanto, torna-se necessário o desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de resistência a begomovírus. Nesta investigação, foram exploradas tanto estratégias para manipulação de resistência dominante quanto silenciamento de genes de resistência recessiva na planta modelo Arabidopsis thaliana. Para garantir resistência dominante, foi utilizado o gene NIK1 [Nuclear shuttle protein (NSP)-interacting kinase 1] que protege plantas contra begomovírus em interações incompatíveis, mas cuja resistência é superada pela proteína de geminivírus NSP em hospedeiros suscetíveis. Plantas Columbia (Col-0) e nocaute nik1-1 foram transformadas com o mutante simples NIK1-T469A e duplo NIK1-T474D/T469A sob o controle do promotor 35S. As plantas transformadas foram confirmadas por PCR, obtendo-se cinco linhagens expressando o duplo mutante e duas linhagens, o mutante simples. Com inserção única do gene e em homozigose, as plantas Col-0 transformadas exibiram alta expressão dos transgenes, e os mutantes complementados com o duplo mutante, exibiram baixa expressão do transgene. Foi observado que a expressão dos mutantes NIK1-T469A e NIK1-T474D/T469A reprimiram acentuadamente a expressão dos genes marcadores da via de imunidade antiviral mediada por NIK1, RPL28, S25, PSII e FD1. Consistente com esses resultados, as plantas superexpressando NIK1-T469A e NIK1-T474D/T469A apresentam menor comprimento da raiz. Todas as plantas mutantes demonstraram baixo acúmulo viral, e baixos sintomas da infecção por CabLCV, comparados com as plantas Col-0, nik-1 e NIK1-8 (uma linhagem complementando o gene NIK1 intacto). Estes resultados indicam que os mutantes NIK1-T469A e NIK1-T469A/T474D são constitutivamente ativados e conferem resistência contra geminívírus em Arabidopsis. No caso de resistência recessiva, inicialmente foi confirmado o carater recessivo do gene NIG. Para isso, foi demonstrado que plantas nig-1 submetidos à infecção por begomovírus acumularam menor carga viral e exibiram sintomas atenuados quando comparadas com Col-0. Além disso, foi examinado o efeito do silenciamento dos genes de suscetibilidade NIG e NISP no desenvolvimento de Arabidopsis. Inativação de NIG ou NISP não causou efeitos adversos no desenvolvimento e crescimento das linhagens silenciadas nig-1 ou nisp-1 comparados com Col-0. Para obter resistência recessiva mais eficaz, foi utilizado a tecnologia CRISPR/Cas para o duplo silenciamento dos genes NIG e NISP. Foi inicialmente construído o cassete contendo os RNAs guias de NISP e então inserido no vetor de transformação de plantas contendo o gene Cas pela técnica de Golden Gate. As plantas nocautes nig-1 foram transformadas com o vetor do CRISPR/Cas nisp-pHEE-401E, e as plantas selecionadas fora confirmadas por PCR. Foi possível confirmar plantas editadas em apenas um alelo do gene de NISP, demonstrando a funcionabilidade dessa técnica. Experimentos estão em progresso para selecionar os mutantes duplos nisp/nig em homozigose e avaliar o efeito do silenciamento duplo dos genes recessivos na resistência contra begomovírus. Palavras-chave: Geminiviridae. Begomovirus. NIK1. Resistencia dominante. NIG. NISP. Resistência recessiva. Arabidopsis. CRISPR/CAS. Duplo mutante. Duplo nocaute.

Begomovirus is the largest genus of the Geminiviridae family, one of the most prominent plant viruses, whose species infect a variety of monocots and dicots and represent severe limitations to agricultural productivity worldwide. This broad spectrum of host ranges results from sophisticated strategies developed by geminiviruses to overcome the arsenal of antiviral defenses in such diverse plant species. Therefore, it is necessary to develop molecular strategies to obtain resistance to begomoviruses. This investigation explored both strategies for manipulating dominant resistance and silencing recessive resistance genes in the Arabidopsis thaliana model plant. To ensure dominant resistance, we used the NIK1 [Nuclear shuttle protein (NSP)- interacting kinase 1] gene, which protects plants against begomoviruses in incompatible interactions, but whose resistance is overcome by the geminivirus protein NSP in susceptible hosts. Columbia (Col-0) and nik-1 knockout plants were transformed with the NIK1-T469A single mutant and NIK1-T474D/T469A double mutant of NIK1 under the control of the 35S promoter. The transformed plants were confirmed by PCR, obtaining five lines expressing the double mutant and two lines expressing the single mutant. Homozygous single gene insertion plants in Col-0 exhibited high expression of the transgenes, and nik1-1 complemented with the double mutant exhibited low transgene expression. NIK1-T469A and NIK1-T474D/T469A severely repressed the expression of the marker genes for the NIK1-mediated antiviral immunity pathway, RPL28, S25, PSII, and FD1. Accordingly, NIK1-T469A and NIK- 1T474D/T469A plants exhibited shorter roots. All mutant plants showed low viral accumulation and attenuated symptoms of CabLCV infection, compared to Col-0, nik- 1 and NIK1-8 (a line expressing intact NIK1) plants. These results indicate that the T469A and T69A/T474D mutants are constitutively activated and confer resistance to geminiviurs in Arabidopsis. In the case of recessive resistance, initially, the recessive character of the NIG gene was confirmed. For this, nig-1 plants infected with begomovirus were demonstrated to accumulate a lower viral load and exhibit attenuated symptoms compared to Col-0. Furthermore, we examined the effect of silencing NIG and NISP susceptibility genes on Arabidopsis development. Inactivation of NIG or NISP did not cause adverse effects on the development and growth of the nig-1 or nisp-1 knockout plants compared to Col-0. We used the CRISPR/Cas technology for the double silencing of NIG and NISP for a more effective recessive resistance. A cassette containing the guide RNAs of NISP was first constructed and then inserted in a plant transformation vector containing the Cas gene by the Golden Gate technique. The nig-1 knockout plants were transformed with the CRISPR/Cas vector nisp-pHEE-401E, and the selected plants were confirmed by PCR. Plants edited in only one allele of NISP were confirmed, demonstrating the functionality of this technique. Experiments are in progress to select homozygous nisp/nig double mutants to evaluate the effect of double silencing recessive genes on resistance against begomoviruses. Keywords: Geminiviridae. Begomovirus. NIK1. Dominant resistance. NIG. NISP. Recessive resistance. Arabidopsis. CRISPR/CAS. Double mutant. Double knockout.