Expressão dos genes sintéticos prM e E do vírus dengue-3 em Pichia pastoris: avaliação do uso em diagnóstico da dengue e análise do potencial imunogênico das proteínas

Abstract

A dengue é a principal arbovirose que acomete humanos da atualidade. Com o número de casos cada vez maior é essencial a produção em larga escala de antígenos para o desenvolvimento de kits de diagnóstico rápidos para a detecção de pacientes infectados pelos vírus e a consequente intervenção médica adequada para os mesmos. Além disso, não há vacina eficaz disponível contra esta moléstia que acomete grande parte da população mundial. Assim, neste trabalho nós expressamos as proteínas prM e E do vírus dengue-3 em leveduras Pichia pastoris KM71H. As proteínas foram produzidas de forma solúvel no sobrenadante da cultura sob a forma de vírus- like particles (VLPs). O sobrenadante da cultura de leveduras foi submetido à purificação de proteínas através de cromatografia de afinidade usando uma coluna de níquel, porém sem êxito. Assim, o mesmo foi submetido a precipitações com concentrações de saturação crescentes de sulfato de amônio. Após confirmação por Western Blot, a fração de 20% de sulfato de amônio foi utilizada como antígeno em teste de ELISA indireto utilizando soros de pacientes, fornecendo sensibilidade de 73,91% e especificidade de 82,61%. Já a fração proveniente da precipitação com 80% mostrou-se mais satisfatória, fornecendo um teste com 82,61% de sensibilidade e 89,25% de especificidade para a detecção de anticorpos IgM específicos. Ainda, a fração e 80% foi utilizada para a pesquisa de anticorpos IgG específicos contra o vírus, fornecendo 76,09% de sensibilidade e 84,78% de especificidade. As frações de 20% e 80% foram avaliadas também quanto à sua capacidade de gerar respostas imunes contra o vírus dengue-3 em camundongos. Foi observada uma indução de resposta imune Th2, verificado pelo aumento da produção de IL-4 e IL-10 quando as células dos baços dos animais previamente imunizados foram estimuladas com o vírus dengue-3. Também foi induzida a produção anticorpos específicos nestes animais, mostrado através de imunofluorescência indireta utilizando-se os soros dos camundongos imunizados. Além disso, foi determinada a capacidade neutralizante de tais anticorpos, com um título de 512 de anticorpos neutralizantes. Também foi detectado nos animais imunizados com as proteínas recombinantes um aumento na população de células TCD4 ativadas e TCD4 de memória central. Dessa forma, a metodologia aqui proposta mostrou-se promissora para a obtenção de antígenos dos vírus dengue na busca por um candidato vacinal eficaz e criação de testes diagnósticos rápidos e baratos, o que é de grande valia uma vez que grande parte das áreas atingidas pela dengue são economicamente negligenciadas.

Dengue is a major arbovirus affecting humans today. With the growing number of cases, it is essential to have large-scale production of antigens for the development of diagnostic kits for the rapid detection of patients infected by the virus and consequent proper medical intervention for them. Furthermore, there is no effective vaccine available against this disease that affects much of the world's population. In this work we express the prM and E proteins of dengue-3 virus in yeast Pichia pastoris KM71H. The proteins were produced in soluble form in the supernatant of the culture in the form of "virus-like particles" (VLPs). The supernatant of yeast culture was subjected to protein purification by affinity chromatography using a nickel column, but without success. Thus, the supernatant was subjected to precipitation with increasing concentrations of ammonium sulfate. After confirmation by Western Blot, the fraction of 20% of ammonium sulfate was used as antigen in an indirect ELISA test, using patients serum providing a sensitivity of 73.91% and specificity of 82.61%.The fraction from the precipitation with 80% proved more satisfactory, providing a test with 82.61% of sensitivity and 89.25% specificity for the detection of specific IgM antibodies. Further, the fraction of 80% was used for the detection of specific IgG antibodies against the virus, providing 76.09% of sensivity and 84.78% of specificity. The fractions of 20% and 80% were also evaluated for their ability to generate immune responses against dengue-3 virus in mice. An induction of immune response Th2 was observed, checked by increased production of IL-4 and IL-10 when the cells from the spleens of immunized animals were stimulated with dengue-3 virus. Also there as a induction of specific antibodies in these animals, as shown by indirect immunofluorescence using the sera of mice immunized. Moreover, the neutralizing ability of such antibodies was determined with a title of 512. Also an increase was detected in animals immunized with the recombinant protein in the population of activated TCD4 cells and central memory TCD4 cells. Thus, the methodology proposed here showed promise for obtaining antigens of dengue viruses in search for an effective vaccine candidate and creating quick and inexpensive diagnostic tests, which is of great value since large portions of the areas affected by this disease are economically neglected.