Potential use of multiplex real-time PCR to develop a kit for identification of beer-spoilage microorganisms

Abstract

Beer is the most consumed alcoholic beverage globally. Despite being considered a microbiologically stable beverage due to its intrinsic properties such as low pH, high CO2, presence of antimicrobial compounds from hop and other factors, microbiological contamination in beer does happen, leading to off-flavor production with changes in flavor and aroma, viscosity, acidification, among other unwanted effects. This study explores the use of multiplex real-time PCR (qPCR) coupled to High Resolution Melting (HRM) analysis for the simultaneous detection and discrimination of beer-spoilage microorganisms genera. Orthologous sequences were identified using the OrthoMCL pipeline for primer design. The designed primers exhibited high specificity, generating distinct melting peaks for the target genera. Sensitivity was confirmed, with successful amplification at low DNA concentrations. The perfect alignment of primers with target regions significantly influenced sensitivity. The multiplex qPCR-HRM approach demonstrated efficacy in detecting beer-spoilage microorganisms in multiplex reactions. Nonetheless, sensitivity variations among primers underscore the importance of thoughtful design for multiplex reactions with primers within the same sensitivity range. Our pipeline is highly adaptable and can be applied not only to the detection of various beer-spoilage microorganisms but also to other segments within the food industry, pharmaceutical, oil & gas industry, among others, effectively enhancing cost-efficient quality control measures.

Keywords: Beer-spoilage. Quality control. Multiplex qPCR. HRM. Orthologous genes.A cerveja é a bebida alcoólica mais consumida no mundo. Apesar de ser considerada uma bebida microbiologicamente estável devido às suas propriedades intrínsecas, como baixo pH, alto teor de CO2, compostos antimicrobianos provenientes do lúpulo e outros fatores, a contaminação microbiológica na cerveja ocorre, levando à produção de sabores indesejados como mudanças no sabor e aroma, viscosidade, acidificação, entre outros efeitos indesejados. Este estudo explora o uso do PCR em tempo real (qPCR) multiplex combinada com análise de High Resolution Melting (HRM) para a detecção e discriminação simultânea de gêneros de microrganismos contaminantes da cerveja. Sequências ortólogas foram identificadas usando a pipeline OrthoMCL para o design de primers. Os primers desenhados apresentaram alta especificidade, gerando curvas de melting distintas para cada gênero. A sensibilidade foi confirmada, com amplificação baixas concentrações de DNA. O alinhamento perfeito dos primers com regiões-alvo influenciou significativamente a sensibilidade. A abordagem multiplex qPCR-HRM demonstrou eficácia na detecção de microrganismos que contaminantes de cerveja em reações multiplex. No entanto, variações de sensibilidade entre os primers ressaltam a importância de um design cuidadoso para reações multiplex com primers dentro da mesma faixa de sensibilidade. Nossa pipeline é altamente adaptável e pode ser aplicado não apenas na detecção de vários microrganismos cervejeiros, mas também em outros segmentos da indústria alimentícia, indústria farmacêutica, óleo & gás, dentre outros, melhorando efetivamente medidas de controle de qualidade com custo competitivo com os métodos tradicionais.

Palavras-chave: Microrganismos contaminantes de cerveja. Controle de qualidade. qPCR multiplex. HRM. Genes ortólogos.