Caracterização molecular de diferentes sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae obtidos no Sudeste do Brasil

Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae é o principal micro-organismo responsável pela pleuropneumonia suína. A existência de 15 diferentes sorotipos descritos para esta bactéria, com diferentes graus de virulência, torna de grande importância a sorotipagem, o estudo de fatores de virulência e o acesso à variabilidade genética de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae. Este trabalho demonstrou a aplicabilidade de duas técnicas de PCR (PCR multiplex com os genes apx e PCR-REA com o gene apxIVA) previamente desenvolvidas na caracterização dos sorotipos de A. pleuropneumoniae e representou o primeiro estudo de variabilidade genética desta bactéria no Brasil, padronizando técnicas moleculares inéditas no estudo deste micro- organismo. Os resultados mostram que os 91 isolados clínicos de A. pleuropneumoniae utilizados neste trabalho são dos sorotipos 2, 5, 7 e 8. Uma grande variabilidade genética nos isolados foi observada examinados pelas técnicas de ERIC-PCR, BOX-PCR e (GTG)5-PCR, o que pode estar relacionado à presença, em elevado número de cópias, do elemento transponível ISApl1 no genoma dos micro-organismos, uma vez que o genoma desta bactéria é relativamente pequeno (2,2 Mpb). A reação de BOX-PCR, particularmente, proporcionou um maior poder discriminativo, uma vez que um fragmento específico para isolados de A. pleuropneumoniae foi observado e a técnica permitiu a separação dos isolados em um maior número de grupos com base em características em comum, como sorotipo, região e ano de isolamento. Adicionalmente, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para caracterizar o gene omlA, que codifica uma proteína da membrana externa de A. pleuropneumoniae e constitui um fator de virulência nesta bactéria. As análises demonstraram a conservação no promotor do gene e a existência de uma região conservada na estrutura da proteína OmlA, provavelmente envolvida na ligação da proteína à membrana da bactéria. O grande polimorfismo presente nas sequências interna e final do gene omlA dos 15 sorotipos permitiu separá-los por reconstrução filogenética e demonstrou a possível diferenciação destes sorotipos em dois eventos evolutivos distintos

Actinobacillus pleuropneumoniae is the main microrganism responsible for porcine pleuropneumonia. The existence of 15 different serotypes described for this bacterium, showing distinct degrees of virulence, highlights the importance of serotyping, the study of virulence factors and the access to the genetic variability of clinical isolates of A. pleuropneumoniae. This work demonstrated the aplicability of two PCR techniques (multiplex PCR with apx genes and PCR- REA with apxIVA) previously developed in the characterization of the serotypes of A. pleuropneumoniae and represented the first study of genetic variability of this bacterium in Brazil, standardizing unplublished molecular techniques in the study of this microorganism. The results show that the 91 clinical isolates used in this work belong to the serotypes 2, 5, 7 or 8. A great genetic variability was observed in the isolates examined by the techniques of ERIC-PCR, BOX-PCR and (GTG)5-PCR, which may be related to the presence, in a high number of copies, of the trasnposablle element ISApl1 in the microorganisms genomes. The reaction of BOX-PCR, particularly, provided a higher discriminative power, once a specific fragment was observed to A. pleuropneumoniae and the tecchnique allowed the separation of the isolates in a higher number of groups based in common characteeristics, such as serotypes, region and year of isolation. Additionaly, bioinformatics techniques were adopted to characterize the gene omlA, which codes a exteral membrane protein and consists a virulence factor in A. pleuropneumoniae. The analysis showed the conservation of the gene promoter and the existence of a conserved region in the structure of the protein OmlA, probably involved in the attachment of the protein to the bacterium membrane. The great polimorphism present in the internal and final sequences of the gene omlA of tthe 15 serotypes allowed their sseparation by phylogenetic reconstruction and demonstrated their possible differentiation n two distinct evolutionary events