Inibição das atividades proteolítica e lipolítica de Pseudomonas fluorescens por nisina.

Abstract

A atividade destas enzimas sobre os constituintes do leite causa diversos problemas como a gelificação e coagulação, sabor e odor indesejados além de rancidez, levando à diminuição do rendimento na fabricação de queijos, perda de qualidade sensorial e diminuição da vida de prateleira dos produtos lácteos. Nisina é uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis utilizada como bioconservante em alimentos em mais de 50 países. Tem ação bactericida contra micro-organismos gram-positivos por se ligar à membrana citoplasmática destes, formar poros que ocasionam o efluxo de eletrólitos e de metabólitos, levando o micro-organismo à morte. Entretanto, micro-organismos gram- negativos são pouco susceptíveis ao mecanismo de ação da nisina, uma vez que a membrana externa atua como barreira, impedindo a passagem da bacteriocina, não permitindo que esta chegue ao seu sítio de ação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inibitório de nisina sobre a atividade das proteases e lipases produzidas por Pseudomonas fluorescens, quantificar as atividades proteolíticas e lipolíticas extra e intracelular na presença e na ausência de nisina e verificar a influência da bacteriocina sobre a transcrição dos genes do operon aprX-lipA. Foi observado que nisina, na concentração de 400 AU/mL não inibe o crescimento celular de P. fluorescens mas, tem efeito inibitório sobre as atividades proteolítica e lipolítica desta bactéria. A atividade proteolítica dos isolados de P. fluorescens denominados L211, L213 e L214 foi inibida em 78, 90 e 92%, respectivamente, no período de 24 h na presença de nisina. Este efeito inibidor foi reduzido no período de 48 h de incubação e variou entre 58% e 60%. A atividade lipolítica dos isolados de P. fluorescens L211 e L213 foi completamente inibida em 24 h de incubação, enquanto o percentual de inibição da atividade lipolítica do isolado L214 foi de 97%. Como observado sobre a atividade proteolítica, a extensão do período de incubação para 48 h reduziu o efeito inibidor da nisina sobre a lipólise e este percentual de inibição variou de 89% à 92%. Não foi observada nenhuma influência da nisina sobre a reação hidrolítica das enzimas secretadas. Porém, não foi possível esclarecer se nisina atua sobre a transcrição dos genes, a síntese ou sobre a secreção da protease e da lipase do micro-organismo. A extração do RNA total foi feita para investigar a transcrição dos genes aprX, lipA, aprD, aprE e aprF, referentes à protease, lipase e as três proteínas do sistema de transporte ABC, respectivamente, em condições de crescimento de P. fluorescens na presença de nisina (400 AU/mL). Estas análises podem ajudar a explicar o mecanismo utilizado por nisina para inibir a atividade enzimática de P. fluorescens.These microorganisms produce proteases and lipases resistant to the Ultra High Temperature (UHT) pasteurization temperatures commonly used by industry as a strategy to ensure the quality and safety of the product. The activity of these enzymes in the milk constituents causes several problems such as milk gelling and coagulation, undesired taste and odor besides rancidity, leading to a decrease in cheese production yield, loss of sensorial quality and shortening the shelf life of the products dairy products. Nisin is a bacteriocin produced by Lactococcus lactis used as a biopreservative in foods in more than 50 countries. It has bactericidal activity against Gram-positive microorganisms to bind to the cytoplasmic membrane of these microorganisms forming pores that cause the efflux of electrolytes and metabolites, taking the microorganism to death. However, by having the outer membrane, Gram-negative bacteria are less susceptible to the mechanism of action of nisin. The outer membrane acts as a barrier, preventing the passage of the bacteriocin and not allowing it to reach its site of action. The objective of this study was to evaluate the inhibitory effect of nisiN on the activity of proteases and lipases produced by fluorescent Pseudomonas, to quantify extra and intracellular proteolytic and lipolytic activities in the presence and absence of nisin and to verify the influence of bacteriocin on the transcription of genes of the aprX-lipA operon. It was observed that nisin, at a concentration of 400 AU/mL, does not inhibit cellular growth but has an inhibitory effect on the proteolytic and lipolytic activities of the enzymes produced by Pseudomonas fluorescens. The proteolytic activity of P. fluorescens L211, [213 and L214 was inhibited at 78, 90 and 92%, respectively; in the period of 24 and the percent inhibition in the 48 h period is 60% for the strains L211 and L213 and of 58 % for L214 strain. The lipolytic activity of P. fluorescens L211 and L213 strains was completely inhibited in 24 h while the percent inhibition of the lipolytic inhibit the hydrolytic reaction of the enzymes after their synthesis and secretion to the external environment. However, it was not possible to clarify whether nisin acts on the secretion, translation or transcription of the protease and lipase genes of the microorganism. RNA extraction of the P. fluorescens was done so that further analysis could be performed. These analyzes may help explain the mechanism used by nisin to inhibit the enzymatic activity of P. fluorescens.