Ciências Agrárias
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Item Caracterização de seqüências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-16) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8; http://lattes.cnpq.br/6208150945096223; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Silva, Felipe Rodrigues da; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4733948J9Seqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como iscas para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.Item Caracterização de recursos genômicos do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) para o desenvolvimento de SSRs e SNPs úteis ao estudo genético e melhoramento da cultura(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-29) Faria, Bárbara Müller Salomão de; Vianello, Rosana Pereira; http://lattes.cnpq.br/4523999698824309; Moreira, Maurílio Alves; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4796105P2; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; http://lattes.cnpq.br/0952987528921052; Novaes, Evandro; http://lattes.cnpq.br/0568272239145336; Souza, Thiago Lívio Pessoa Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/9650183308779143Este trabalho apresenta resultados de pesquisas desenvolvidas no âmbito do Projeto Consórcio internacional para o sequenciamento do genoma e do transcriptoma do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) (Prosul/CNPq e CYTED) conduzido na Embrapa Arroz e Feijão (CNPAF) e na Universidade Federal de Viçosa (UFV), sendo este composto por dois subprojetos distintos: Sequenciamento e caracterização das pontas de BACs e Identificação e desenvolvimento de marcadores SNPs em feijoeiro comum . A dissertação foi estruturada em dois capítulos, cada um derivado de um subprojeto, contendo os objetivos e os principais resultados apresentados a seguir: Capítulo 1- Com o intuito de ampliar e aprofundar o conhecimento sobre a estrutura e composição do genoma de P. vulgaris este estudo teve como objetivo sequenciar uma biblioteca BAC (Bacterial Artificial Chromosome) a partir de suas extremidades (BESs BAC-end sequences) e analisar as sequências quanto à presença de SSRs e a anotação genômica. Ao todo, 52.270 BESs foram geradas e processadas equivalendo a 32 Mpb (6,5%) do genoma de P. vulgaris, com conteúdo de GC estimado em 39%. Foram encontrados um total de 3.789 BES-SSRs, um a cada 8,36 kb. Destes, 2.000 foram adequados para o desenvolvimento de marcadores moleculares, dos quais 194 foram avaliados e 40 deles foram caracterizados quanto a aspectos genéticos operacionais. Das 52.270 BESs, aproximadamente 2% continham sequências que codificavam fatores de transcrição e 3% continham elementos transponíveis. Através da comparação com o banco de dados não-redundante de proteínas do NCBI, foi possível identificar funções putativas para 24.321 BESs, contabilizando 46,53% do total de sequências analisadas. Com base nos termos do Gene Ontology (GO), foram atribuídas categorias funcionais a 19.363 BESs inseridas em processos biológicos (52%), função molecular (65%) e componente celular (22%). Este estudo permitiu identificar com sucesso BES-SSRs altamente polimórficos, buscando motivos SSRs de tri- a hexanucleotídeos, agregando características genéticas adequadas e com potencial de serem utilizados no programa de melhoramento genético de feijoeiro comum. Adicionalmente, as BESs geradas e processadas foram integradas ao projeto internacional de sequenciamento do genoma de feijoeiro comum auxiliando na composição e montagem do mesmo. Capítulo 2- O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar o poder de informação genética de um grupo de 58 marcadores SSRs (24 SSRs-di microssatélites dinucleotídeo e 34 BES-SSRs microssatélites tri- a hexanucleoídeo) e 345 SNPs para aplicações no melhoramento genético de P. vulgaris. Foram avaliados 88 genótipos representativos de 55 acessos melhorados e 33 variedades tradicionais, incluindo oito combinações biparentais composta por cruzamentos inter- e intra-pool gênico. Os SSRs-di apresentaram maior média de alelos por loco gênico (9,916) e revelaram maior diversidade genética média (72,1%), sendo o grupo de marcadores com o maior poder de discriminação genética entre indivíduos. Entre os 58 SSRs, 14 com uma elevada média de alelos privativos (14,93/loco) e diversidade genética (84%) possibilitaram a discriminação individual dos 88 genótipos. Os SNPs polimórficos entre cruzamentos biparentais, intra- (17,7%) e inter-pool gênico (78,2%), foram avaliados quanto à aplicação prática no mapeamento genético. As abordagens utilizadas para inferir a estrutura genética populacional apresentaram resultados similares entre os grupos de marcadores, discriminando os genótipos nos pools gênicos Mesoamericano e Andino, com a maior diferenciação genética (K = 2, FST = 0,895) apresentada pelos SNPs. Os SSRs- di possibilitaram discriminar dentro do pool gênico Mesoamenricano o germoplasma melhorado e tradicional (K = 3). O desequilíbrio de ligação testado para todos os marcadores foi elevado, sendo maior para os SNPs (84,92%), reduzindo significativamente quando avaliado separadamente para os genótipos Andinos e Mesoamericanos. A distribuição dos SSRs e SNPs foi ampla e aleatória em todo o genoma de P. vulgaris. Em termos de resultados práticos para o programa de melhoramento, neste estudo foram derivados painéis de genotipagem operacionais baseado em SSRs e SNPs com alto e eficiente poder de discriminação do germoplasma por origem. Adicionalmente, um conjunto de SNPs polimórficos entre diversas populações biparentais representa uma aplicação adicional dessa tecnologia para geração de mapas genéticos de alta densidade compreendendo uma proporção substancial de marcadores compartilhados entre cruzamentos. Esse estudo contribui para a integração crescente da genômica nos programas de melhoramento, aliando metodologias de genotipagem acessíveis e a baixos custos que permitem amostrar de modo eficiente e/ou amplo o genoma de feijoeiro comum.Item Mapa genético integrado e seleção genômica ampla visando resistência de Coffea arabica L. à ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2013-12-04) Pestana, Kátia Nogueira; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8; http://lattes.cnpq.br/5642596758984532; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Oliveira, Antônio Carlos Baião de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782833P5A obtenção de cultivares de cafeeiros resistentes e produtivos, assim como de informações detalhadas sobre o genoma dessa espécie, demanda uso de ferramentas de análise genética refinada. Por isso, a identificação de marcadores moleculares associados a genes de resistência à ferrugem em mapa genético de ligação tem sido estratégia proposta para incorporar a Seleção Assistida por Marcadores no melhoramento de Coffea arabica. Neste trabalho, foi caracterizada a herança da resistência do Híbrido de Timor UFV 443-03 às raças I e II e ao patótipo 001 de Hemileia vastatrix, assim como localizados em mapa genético de ligação parcial do cafeeiro os genes/QTLs identificados. O mapa genético construído foi integrado em outro mapa parcial pré-existente visando obter um mapa saturado, de referência para a espécie. Nesse mapa, composto por 191 marcadores, cobrindo 1.421,32 cM do genoma, foram identificados dois QTLs associados à raça II de H. vastatrix. Esses marcadores moleculares associados aos QTLs identificados podem ser utilizados para seleção de cafeeiros resistentes à ferrugem. Além dessa estratégia de melhoramento molecular, foi também proposta a seleção genômica com o objetivo de predizer a performance fenotípica dos indivíduos e identificar marcadores moleculares associados à característica de resistência à ferrugem. Neste estudo foram utilizados 245 indivíduos F2, resultantes do cruzamento da cv suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e da fonte de resistência Híbrido de Timor UFV 443-03, genotipados com 137 marcadores moleculares (74 AFLP, 58 SSR, 4 RAPD e 1 primer-específico). As estimativas dos parâmetros genéticos foram obtidas via BLASSO. A capacidade preditiva (CP) foi medida utilizando todos os indivíduos da população como população de treinamento e validação. Além disso, a população foi dividida aleatoriamente em 200 indivíduos para treinamento e 45 indivíduos para validação. No primeiro caso, a maior CP preditiva foi para o patótipo 001 (0,78) e, no segundo caso, para a raça I (0,49). Quando se utilizaram apenas os marcadores de maiores efeitos para cada isolado, a maior CP na população de validação foi para o patótipo 001 (0,49). Ainda foi possível observar que as herdabilidades estimadas por meio dos marcadores moleculares para a resistência aos três isolados foram inferiores às obtidas a partir de dados fenotípicos. Isso demonstra maior predição dos valores genômicos dos indivíduos na seleção genômica em comparação com a fenotípica. A maioria dos marcadores identificados associados aos QTLs no mapa genético de ligação foi também identificada pela GWS, confirmando a acurácia da metodologia utilizada. Além disso, a GWS permitiu predizer, com sucesso, os valores genômicos dos indivíduos.Item Caracterização funcional e identificação de SNPs e de genes de resistência a doenças do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-18) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8; http://lattes.cnpq.br/6208150945096223; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782432A8; Zambolim, Laércio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787254T6; Oliveira, Antônio Carlos Baião de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782833P5O Projeto Brasileiro do Genoma Café gerou um banco de dados de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Estas sequências estão armazenadas no banco de dados do Projeto, o CafEST. Em trabalho anterior, foi realizada análise in silico das sequências do CafEST, a qual permitiu a identificação de 14.060 sequências relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças. Dessas 14.060, 1.855 foram sequências cujos produtos preditos eram quitinases. Dada a importância das quitinases, tanto na interação planta-patógeno, como em outros processos da planta, as ESTs de quitinase foram detalhadamente analisadas no presente trabalho. Para isso foi realizada uma caracterização funcional e construído um perfil de expressão in silico. A categorização funcional foi feita com o software Blast2GO e o perfil de expressão gênica in silico foi determinado por meio de análises de Northern Blot Virtual. Os resultados da caracterização funcional mostraram a versatilidade das quitinases, que possuem atividade enzimática e estão envolvidas em importantes processos biológicos e funções moleculares nas células da planta. A análise do perfil de expressão in silico permitiu verificar que as quitinases estão mais expressas, principalmente, em bibliotecas que apresentam algum componente de estresse. Para selecionar, entre as 14.060 sequências mineradas, aquelas que estão envolvidas com a resistência do cafeeiro à ferrugem, foram desenvolvidos, em trabalho anterior, 40 pares de primers. Os primers foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo que um deles foi polimórfico entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis. No presente trabalho, 15 primers monomórficos foram escolhidos para análises de polimorfismos de base única (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) nas sequências de DNA entre os 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. As sequências obtidas foram analisadas com os programas Sequencher® v. 4.10, ORF Finder, BLAST e ClustalW. Dos 15 genes, quatro não apresentaram nenhum SNP. Cinco genes apresentaram SNPs, mas os polimorfismos foram observados apenas para o clone da espécie Coffea liberica var. dewevrei (café excelsa). Os outros seis genes foram polimórficos entre os genótipos amostrados. Foram detectados 71 SNPs, sendo que 34 foram transições (47,89%) e 37 transversões (52,11%). A taxa de transições/ transversões foi de 0,9189. Das 71 substituições, 27 ocorreram na primeira posição do códon (38,02%), 15 na segunda posição (21,12%) e 29 na terceira (40,84%). Foram detectadas 11 (15,49%) substituições sinônimas e 60 (84,51%) substituições não sinônimas. A relação de substituições sinônimas/não sinônimas foi de 0,1833. Um alto nível de mutações não sinônimas, como o que foi encontrado neste trabalho, pode ser reflexo de seleção positiva. Um exemplo é o cenário antagonista da coevolução patógeno-hospedeiro, onde os genes do hospedeiro estão engajados numa corrida armamentista evolucionária e sob forte pressão de seleção para mudarem e se adaptarem. Em função disso, eles evoluem numa taxa mais rápida que outros genes. Este cenário pode ser aplicado ao presente trabalho, dado o alto nível de modificações não sinônimas detectado e ao fato que os genes analisados atuam, de alguma forma, no processo de defesa do cafeeiro contra patógenos. Foi observada uma frequência de 0,1029 SNPs por amplicon. Nos 119.061 pb analisados detectou-se uma frequência extremamente baixa de 1 SNP a cada 1.676,91pb, ou de 0,0596 SNPs por 100 pb. Pode-se atribuir o baixo nível de polimorfismo observado à baixa diversidade do genoma de C. arabica. A análise dos produtos gênicos permitiu verificar que as mutações não sinônimas identificadas não levaram à formação de proteínas preditas distintas. No presente trabalho foi também iniciada a clonagem de um gene potencialmente envolvido com a resistência do cafeeiro a ferrugem. Em trabalho anterior, foi identificado um fragmento de gene de resistência, amplificado pelo primer CARF 005, presente nos indivíduos resistentes e ausente nos susceptíveis à ferrugem do cafeeiro. Esse primer foi utilizado no presente trabalho para realizar um screening de uma biblioteca de BACs (Bacterial Artificial Chromosome Cromossomo Artificial de Bactéria) contendo 56.832 clones Na identificação do(s) clone(s) positivo(s), utilizou-se o método de decomposição de pools. Foram identificados dois clones positivos (i. e. dois clones contendo fragmento de gene de resistência amplificado pelo marcador CARF 005). Os dados de sequenciamento dos dois clones identificados poderão fornecer informações importantes sobre a estrutura dos genes de resistência em Coffea.