Teses e Dissertações
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Teses e dissertações defendidas no contexto dos programas de pós graduação da Instituição.
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Item Caracterização cinética da isocitrato desidrogenase de mitocôndrias de batata e de soja(Universidade Federal de Viçosa, 1999-07-28) Borges, Regis; Silva, Marco Aurélio Pedron e; http://lattes.cnpq.br/9673696798282013Este trabalho teve por objetivo avaliar a regulação da atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + (NAD + -IDH), por cátions divalentes e nucleotídeos de adenina, em mitocôndrias vegetais. Para isto, utilizaram-se extratos enzimáticos de mitocôndrias isoladas de hipocótilos e raízes de soja e de tubérculos de batata, tendo a atividade da enzima sido determinada, espectrofotometricamente, pela redução do NAD + a 340 nm. A NAD + -IDH, independente da fonte da enzima, apresentou atividade ótima em pH 7,5 e temperatura de 35 o C. O armazenamento em banho de gelo ocasionou perda progressiva de atividade enzimática, semelhante para os materiais utilizados. A -20 o C, a enzima extraída de soja mostrou maior estabilidade, em função do tempo, que a de tubérculos de batata. Os cátions Mn 2+ e Mg 2+ estimularam a atividade da enzima, além de reverterem os efeitos do EGTA, porém, o Ca 2+ não teve as mesmas influências. Houve pequena diminuição da atividade enzimática em presença do ADP e uma diminuição da atividade enzimática mais drástica em resposta ao ATP, independente da fonte da enzima. O cálcio não interferiu no efeito dos nucleotídeos de adenina. Os valores de K M app e V máx app aparentes não foram alterados pelo cálcio. Em média, os valores de K M app foram em torno de 0,10 mM. Para as mitocôndrias de batata V máx app foi de 28 nm min -1 e para soja, em torno de 13 nm min -1 . Os dados não permitem associar a capacidade de mitocôndrias em acumular Ca 2+ com um possível controle diferencial deste cátion sobre a atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + .Item Efeito do ácido jasmônico sobre lipoxigenases de folhas de soja(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-10) Colombo, Lucinete Regina; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://lattes.cnpq.br/2983600944854240Este trabalho foi realizado com a variedade comercial de soja IAC-12 e a linha quase-isogênica dela derivada (IAC-12 TN), com ausência de lipoxige- nase (LOX) em suas sementes, com dois objetivos básicos: verificar o efeito do ácido jasmônico sobre as LOX foliares e analisar se a eliminação genética das LOX das sementes não alterou o pool de LOX das folhas. Foram determinados parâmetros cinético-bioquímicos do pool de LOX dos dois genótipos, nos tem- pos de 12, 24 e 48 horas após o tratamento com ácido jasmônico. O pH ótimo foi semelhante entre os dois genótipos, em torno de 6,0. Observou-se também um segundo pico de atividade, em torno de pH 4,5. As análises de temperatura indicaram maior atividade em torno de 25 0 C para o valor de pH 6,0. O parâme- tro cinético K M aparente (K M app) foi menor no tempo de 24 horas em ambos os genótipos, tratados ou não com ácido jasmônico. O genótipo IAC-12 exibiu maior K M app quando tratado com ácido jasmônico, ao passo que IAC-12 TN apresentou menor K M app quando tratado do que o controle, entretanto, em ambos os casos, as diferenças não foram acentuadas. Os dados obtidos indicaram que a remoção genética das LOX de semente de soja não influencia o pool de LOX foliares nem a sua resposta ao ácido jasmônico.Item Metabolismo do nitrogênio em Phaseolus vulgaris L. durante senescência foliar induzida por deficiência de fósforo(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-05) Medeiros, Juliana Carvalho Gonçalves Dias de; Mosquim, Paulo Roberto; http://lattes.cnpq.br/8849275400732166Com o objetivo de verificar se a deficiência de P é um sistema experimental adequado para o estudo da senescência, e se há redistribuição mais eficiente de P em cultivares melhoradas para menor requerimento, foi avaliado o metabolismo de N durante senescência foliar induzida por deficiência de P, em duas cultivares de Phaseolus vulgaris L. com diferentes requerimentos de P. Plântulas das cultivares POT 51 (baixo requerimento) e Pérola (alto requerimento) foram crescidas em solução nutritiva completa, e, em seguida, transferidas para soluções deficientes em P. Após uma semana de deficiência, foram medidos, a cada três dias, nos trifólios senescentes, os teores de clorofilas e proteínas solúveis e as atividades da NR, da GS e da NADH-GDH. Também foram determinados os níveis das isoformas citossólica (GS 1 ) e cloroplastídica (GS 2 ) de GS e os teores de N e P (medidos também no trifólio mais jovem completamente expandido). Nas duas cultivares, tanto em senescência natural quanto induzida, foi observada remobilização de N, sendo esta, acelerada após aplicação da deficiência. Os níveis de N se mantiveram nos trifólios jovens, enquanto os de P caíram, paralelamente aos dos trifólios senescentes. Nas duas cultivares, a indução de senescência acelerou o início da perda de clorofila, mas não da de proteínas solúveis. As atividades da GS e da NR caíram progressivamente, sendo a queda acelerada após aplicação da deficiência, nas duas cultivares. Tanto durante senescência natural quanto induzida, a queda da atividade da GS foi causada pela diminuição dos níveis de GS 2 . Os níveis de GS 1 aumentaram, sugerindo seu papel na remobilização de N. As atividades real e potencial da NR foram mais altas em Pérola que em POT 51, tanto em senescência natural quanto induzida. Apenas nos estádios mais avançados, as cultivares apresentaram atividades iguais. Durante senescência natural, a atividade da NR apresentou limitação por substrato nas duas cultivares. Em senescência induzida, a atividade foi limitada, possivelmente, pela concentração da enzima. Em Pérola, a atividade da NADH-GDH diminuiu durante a senescência natural e aumentou durante a induzida. Em POT 51, a atividade manteve-se constante e não houve efeito de tratamento. Durante a senescência induzida, a maioria dos parâmetros acompanhados apresentou perfis similares aos observados durante a natural. Conclui-se que a aplicação da deficiência de P é um sistema adequado para o estudo do metabolismo de N durante a senescência foliar em feijão. Não ficou claro se POT 51 é mais eficiente na remobilização de P.Item Caracterização bioquímica da proteína S-64, envolvida no transporte de sacarose em soja (Glycine max (L.) Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-04) Pirovani, Carlos Priminho; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/9615448923708075O cDNA da proteína S-64, homóloga à proteína de ligação à sacarose (SBP), foi previamente isolado de uma biblioteca de expressão de cotilédones de soja. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína S-64 apresenta 85% de identidade com a proteína de ligação à sacarose (SBP), um provável sinal, um sítio consenso de glicosilação e um sítio consenso de ligação à ATP/GTP. Nessa investigação, uma versão truncada da proteína S-64 foi expressa em E. coli e a proteína recombinante purificada, utilizada em ensaios de caracterização bioquímica. Além da alta conservação de seqüência com SBP, o fracionamento subcelular de cotilédones demonstrou que a proteína S-64 está associada a membranas. Consistente com sua localização subcelular, o terminal amino hidrofóbico da proteína parece ter função de Peptídeo sinal, uma vez que a proteína intacta não foi acumulada em E. coli, ao passo que a proteína S-64 isenta do Peptídeo sinal foi eficientemente sintetizada em bactéria. Provavelmente, o sistema de secreção da E. coli reconheceu o terminal hidrofóbico da proteína intacta, e a proteína recombinante foi secretada e degradada. No entanto, tradução in vitro do RNA sintético de S-64 usando reticulócitos de coelho, na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas, demonstrou que o Peptídeo sinal de S-64 não é clivado. Tal resultado indicou que a proteína S-64 é uma proteína de membrana do tipo II, e o seu terminal amino apresenta as funções de Peptídeo sinal, endereçando a proteína para o retículo endoplasmático; e domínio transmembrana, fixando a proteína na membrana plasmática. A capacidade de S-64 oligomerizar foi avaliada em géis semidesnaturantes e o seu domínio de oligomerização mapeado, correspondente aos aminoácidos 36 a 343, usando-se versões truncadas da proteína. A possibilidade de a proteína ligar-se à GTP por meio do seu sítio consenso de ligação a nucleotídeos foi determinada por “GTP dot blot”. A proteína S-64 liga-se à GTP, preferencialmente à ATP, uma vez que uma versão de S-64 produzida em E. coli foi marcada radioativamente por [ 32 Pα]-GTP, na presença de ATP não marcado como competidor. O sítio de ligação à GTP foi delimitado pelo teste de perda de função a partir de mutação dirigida in situ. De fato, mutação no putativo sítio de ligação a ATP/GTP bloqueia a referida atividade da proteína. Tais resultados estabelecem que a proteína S-64 é, de fato, uma proteína de ligação à GTP associada à membrana. A atividade de ligação à GTP da proteína pode estar envolvida na regulação da função da proteína como transportadora de sacarose.Item Análise dos constituintes químicos do pólen e da inflorescência de Stryphnodendron polyphyllum, em relação à cria-ensacada brasileira em Apis mellifera(Universidade Federal de Viçosa, 1999-08-18) Santos, Mara Lúcia de Azevedo; Message, Dejair; http://lattes.cnpq.br/4346386170135221O objetivo deste trabalho foi analisar os constituintes químicos do pólen de Stryphnodendron polyphyllum (barbatimão), causador da doença cria-ensacada brasileira (CEB) em Apis mellifera. Para isso, coletaram-se pólen e inflorescência de barbatimão para serem submetidos a extrações sucessivas com hexano e, posteriormente, com etanol. Com os extratos hexânico e etanólico do pólen e da inflorescência obtidos, foram realizados ensaios biológicos, nos quais se verificaram pré-pupas com sintomas da doença nos tratamentos em que as larvas eram alimentadas com dieta de operária mais extrato etanólico. Observou-se a presença de taninos nos extratos etanólicos, tendo sido determinado nestes 7,91 e 21,43% de taninos no pólen e na inflorescência, respectivamente. Com o fracionamento do extrato etanólico do pólen, isolaram-se ainda ácidos graxos e frutose, que foram submetidos a ensaios biológicos. Essas frações não determinaram o aparecimento de sintoma da CEB nas abelhas tratadas. Como várias espécies de barbatimão são conhecidas por possuírem altas concentrações de tanino, realizaram-se ensaios biológicos com concentrações diferentes de ácido tânico para verificar o seu efeito no desenvolvimento das crias de abelhas. Observou-se a presença de sintomas da doença e de alta mortalidade das crias tratadas a partir da terceira alimentação com dieta contendo diferentes concentrações de ácido tânico, tendo sido estimada uma CL50 de 0,012% no referido composto. Diante desses resultados, concluiu-se que o constituinte químico responsável pelos sintomas da cria-ensacada brasileira está presente na fração etanólica do pólen, podendo pertencer ao grupo dos taninos. Os resultados dos ensaios biológicos obtidos com a inflorescência foram semelhantes àqueles conseguidos com o pólen.Item Mapeamento genético do cacaueiro e identificação de QTLs para resistência à vassoura-de-bruxa(Universidade Federal de Viçosa, 1999-10-18) Queiroz, Vagner Tebaldi de; Moreira, Maurilio Alves; http://lattes.cnpq.br/9963384168622230Uma progênie de 82 indivíduos F2, obtida do cruzamento entre Scavina-6 e ICS-1, foi analisada utilizando marcadores moleculares. Por meio das técnicas de RAPD e AFLP, foram amplificados 196 fragmentos polimórficos, que foram distribuídos em 26 grupos de ligação. Estes marcadores cobriram uma distância de recombinação de 1.733 cM, com distância média entre dois marcadores adjacentes de 8,84 cM. Análises de regressão simples e múltipla e mapeamento por intervalo foram utilizados para detectar e mapear regiões genômicas associadas com a resistência à vassoura-de-bruxa. A proporção da variância fenotípica explicada por marcador variou entre 8,4%, para o loco iacacac.261, e 12,7%, para o loco sacgcat.78. Dos seis marcadores associados à resistência à vassoura-de-bruxa a 1% de probabilidade, os marcadores iAE06.950, saggcat.108 e iAB09.464 foram mantidos no modelo de regressão múltipla, utilizando o método de eliminação stepwise. Os três marcadores explicaram juntos 27,8% da variação fenotípica. Através do mapeamento por intervalo, foram identificadas associações significativas a 5% de probabilidade, nos grupos de ligação 01 e 11. No grupo de ligação 01 foram identificados três QTLs, flanqueados pelos marcadores iaagctc.65 - iBB12.1100, iAH18.850 - iBG09.580 e iAC01.475 - iAS19.970. O grupo 11 apresentou dois QTLs altamente significativos (P < 0,01) entre os marcadores saggcat.108 - sAV14.940 e sAV18.590 - sZ04.500. Os marcadores identificados pela análise de regressão múltipla também o foram pelo mapeamento por intervalo, com exceção do marcador iAB09.464, que não se encontra ligado no mapa de ligação construído no presente trabalho.Item Clonagem e caracterização molecular de dois Begomovirus que infectam Sida rhombifolia(Universidade Federal de Viçosa, 1999-08-06) Fernandes, Andreia Varmes; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/6312576667020247A família Geminiviridae é constituída por vírus de plantas que possuem genomas de DNA circular de fita simples. Atualmente, está dividida em três gêneros, Mastrevirus, Curtovirus e Begomovirus, de acordo com o inseto transmissor, o tipo de hospedeiro e a organização do genoma, possuindo um ou dois componentes. A presença de geminivírus em plantas de Sida rhombifolia com sintomas de infecção viral foi detectada, em nível molecular, por PCR e “Southern blot”. O vírus proveniente de uma das amostras de Sida rhombifolia foi propagado em Nicotiana benthamiana via biolística, induzindo o sintoma de mosqueado. O componente A desse vírus foi clonado, seqüenciado e submetido à análise de comparação de seqüências, a qual indicou tratar-se de um novo Begomovirus. Pela análise filogenética, esse componente foi classificado como pertencente a um Begomovirus do hemisfério ocidental, que foi denominado vírus do mosqueado de Sida, SMoV. Entretanto, o componente B cognato desse vírus não foi encontrado. Uma segunda amostra de Sida rhombifolia com sintoma de mosaico foi utilizada para clonagem direta do componente A, por meio de amplificação do componente genômico completo, utilizando-se iniciadores específicos. O componente A foi clonado e seqüenciado, e a análise da seqüência indicou a classificação como Begomovirus do hemisfério ocidental, sendo denominado vírus do mosaico amarelo de Sida, SYMV. Ambos os vírus (SMoV-A e SYMV-A) foram inoculados em plantas indicadoras por biolística, mas nenhuma planta apresentou sintoma de infecção viral. Tais resultados foram coerentes com a classificação filogenética dos dois novos Begomovirus, indicando que, provavelmente, SMoV e SYMV possuem dois componentes, embora o componente B de SYMV e SMoV não tenham sido detectado em amostras de Sida com sintomas. Ensaios de infecção mista evidenciaram que SMoV-A é funcional e se move sistemicamente em Nicotiana benthamiana na presença de proteínas de movimento heterólogas, fornecidas in trans. SMoV-A foi detectado por “Southern blot” em folhas apicais de N. benthamiana infectada com TGMV-A, TGMV-B e SMoV-A. A identificação de pelo menos dois novos Begomovirus em Sida rhombifolia indicou que esses vírus são facilmente adaptados a essas plantas. A ocorrência de ambos os vírus em uma mesma planta pode facilitar a recombinação interespécie, contribuindo para o processo evolutivo dessa família de fitovírus.Item Caracterização da “via das lipoxigenases” em plantas de soja submetidas ao ataque de insetos-praga(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-05) Silva, Francine Barbosa; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/8372569217064422Lipoxigenases (EC: 1.13.11.12) são enzimas que catalisam a dioxigenação estereoespecífica de ácidos graxos polinsaturados que contêm o sistema cis,cis-1,4-pentadieno, formando hidroperóxidos que são posterior- mente metabolizados e produzem substâncias com atividades fisiológicas pronunciadas. As LOXs são responsáveis pela formação de compostos orgânicos responsáveis pelo “beany flavor” das sementes de soja, que reduz drasticamente a utilização desta oleaginosa na alimentação humana. Uma estratégia na eliminação deste sabor indesejável é a retirada, através de manipulação genética, das LOXs de semente. Além disso, é descrito o envolvimento dessas isoenzimas no crescimento e desenvolvimento, na senescência e na biossíntese de moléculas regulatórias. Este trabalho avaliou a capacidade da planta em responder ao ataque de insetos-praga (um mastigador e outro sugador) pela “via das lipoxigenases”, tendo sido realizadas análises bioquímicas e cinéticas do “pool” de lipoxigenases foliares e dos possíveis produtos finais da via. Foram utilizados dois genótipos de soja: um normal (variedade IAC-100) e outro com ausência completa de lipoxigenases nas sementes (linhagem IAC-100 TN). As plantas foram submetidas a uma população de insetos-praga (lagarta da soja ou mosca-branca) em gaiolas de filó. Para lagarta da soja, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 6, 12 e 24 horas após o ataque da planta pelo inseto. A seguir o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. No caso da mosca-branca, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 12, 24, 48 e 72 horas após o ataque da planta pelo inseto. Em seguida o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. Os resultados das análises bioquímico-cinéticas revelaram dois picos mais acentuados de atividade e atividade específica de lipoxigenases a pH 4,5 e 6,0 nos dois tratamentos, com temperatura ótima de atividade e atividade específica a 25 oC. Para ambos os genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos do que nos respectivos controles. Para a lagarta da soja, os valores de KM aparente, determinados no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados, diminuíram a partir de 6 até 24 horas, em presença do inseto, e de 6 até 48 horas, após remoção do inseto. Para a mosca-branca, os valores de KM aparente no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados decresceram com o tempo de ataque, ou seja, de 12 até 72 horas, em presença do inseto; após a remoção do inseto, estes valores voltaram a aumentar. A variação no valor de KM aparente para ambos os genótipos sugere uma alteração do “pool” de lipoxigenases em resposta ao ataque de insetos. Tanto no experimento com lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis Hübner) quanto naquele com mosca-branca (Bemisia argentifolii), observou-se aumento significativo na produção de inibidores de proteases após a remoção dos insetos, para ambos os genótipos analisados. Esses resultados, aliados aos dados obtidos para as constantes cinéticas, reforçam a hipótese de que as isoenzimas lipoxigenases são enzimas-chave no sistema de defesa de plantas de soja contra herbívoros e que o acúmulo de inibidores de proteases é, provavelmente, um mecanismo de defesa da planta. As análises dos níveis de hexanal e aldeídos totais nos dois experimentos revelaram aumento significativo nos níveis de aldeídos totais após a remoção dos insetos, para os dois genótipos, no tratamento com lagarta; e aumento mais significativo para mosca-branca antes da remoção, para a linhagem IAC- 100 TN. Uma produção significativa de hexanal só ocorreu para a variedade IAC-100, no tratamento com mosca-branca. Esses resultados sugerem que o mecanismo de defesa de plantas de soja submetidas ao ataque de insetos- praga, pela via das lipoxigenases, também pode seguir o caminho de produção de aldeídos.