Caracterização cinética da isocitrato desidrogenase de mitocôndrias de batata e de soja

Abstract

Este trabalho teve por objetivo avaliar a regulação da atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + (NAD + -IDH), por cátions divalentes e nucleotídeos de adenina, em mitocôndrias vegetais. Para isto, utilizaram-se extratos enzimáticos de mitocôndrias isoladas de hipocótilos e raízes de soja e de tubérculos de batata, tendo a atividade da enzima sido determinada, espectrofotometricamente, pela redução do NAD + a 340 nm. A NAD + -IDH, independente da fonte da enzima, apresentou atividade ótima em pH 7,5 e temperatura de 35 o C. O armazenamento em banho de gelo ocasionou perda progressiva de atividade enzimática, semelhante para os materiais utilizados. A -20 o C, a enzima extraída de soja mostrou maior estabilidade, em função do tempo, que a de tubérculos de batata. Os cátions Mn 2+ e Mg 2+ estimularam a atividade da enzima, além de reverterem os efeitos do EGTA, porém, o Ca 2+ não teve as mesmas influências. Houve pequena diminuição da atividade enzimática em presença do ADP e uma diminuição da atividade enzimática mais drástica em resposta ao ATP, independente da fonte da enzima. O cálcio não interferiu no efeito dos nucleotídeos de adenina. Os valores de K M app e V máx app aparentes não foram alterados pelo cálcio. Em média, os valores de K M app foram em torno de 0,10 mM. Para as mitocôndrias de batata V máx app foi de 28 nm min -1 e para soja, em torno de 13 nm min -1 . Os dados não permitem associar a capacidade de mitocôndrias em acumular Ca 2+ com um possível controle diferencial deste cátion sobre a atividade da isocitrato desidrogenase dependente de NAD + .This work focused on the regulation of NAD + -isocitrate dehydrogenase, by cations and adenine nucleotides, in plant mitochondria, using enzymatic extracts from soybean roots and hypocotils and potato tuber. NAD + -IDH was assayed by following the reduction of NAD + at 340 nm. Maximum enzyme activity, regardless of the source of the enzyme (potato or soybean), was achieved at pH 7.5 in 25 mM HEPES and 35 o C. Both enzymatic extracts exhibited a progressive and similar loss of activity when stored in an ice bath. The enzymatic extract from soybean mitochondria showed the largest stability under storage at -20 o C. The cations Mn 2+ and Mg 2+ stimulated the enzymatic activity, in addition to reverting the effects of EGTA, even though Ca 2+ was not equally effective. There was a short inhibition of the enzymatic activity in presence of ADP, and a drastic inhibition in response to ATP. Calcium did not change the adenine nucleotides effect. K M app values were not altered by calcium and, on the average, they were in the range of 0.10 mM, regardless the source of the enzyme. The values of V max app were 28 nm min -1 , for potato, and 13 nm min -1 , for soybean. As a whole, the present results do not support the view that mitochondrial capacity in accumulating calcium is associated to the differential control of the calcium on the NAD + -isocitrate dehydrogenase activity.