Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Construção de um sistema de expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em Nicotiana tabacum "Havana" e análise da expressão do transgene(Universidade Federal de Viçosa, 2009-12-15) Amaro, Marilane de Oliveira Fani; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Paula, Sérgio Oliveira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4; http://lattes.cnpq.br/8475779445932134; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0A dengue é a doença mais importante causada por arbovírus no mundo, sendo observado nos últimos vinte anos um aumento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica, transmissão contínua de vários sorotipos e emergência da Febre hemorrágica (DHF) em áreas onde a doença não era prevalente. Apesar dos processos metodológicos de diagnóstico da dengue estar na atualidade em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho na realização de testes diagnósticos para dengue reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura do anticorpo presente no soro de pacientes infectados. Devido a este fator, o objetivo é a obtenção de antígeno em grandequantidade e qualidade utilizando um sistema de expressão heteróloga de proteínas em plantas. Para tanto, foi extraído o RNA total do sobrenadante de cultura de células infectadas e a partir deste foi sintetizado o cDNA. O gene da proteína não estrutural (NS1) do sorotipo dengue 2 foi obtido através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), separado por eletroforese e purificado. O gene foi, então, clonado em vetores pGEM-T e pCAMBIA. Bactérias Escherichia coli DH5α foram transformadas, selecionadas em meio seletivo e estocadas a -80º C. O vetor pCAMBIA foi anteriormente clivado com as mesmas enzimas e o gene da proteína NS1 foi ligado a este por enzima T4 ligase. Nova transformação de E. coli DH5α foi realizada e as colônias foram, então, analisadas quanto a presença do gene que codifica a proteína NS1 através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). As colônias transformantes recombinantes foram selecionadas e estocadas. Este vetor recombinante, pCAMBIA 3301/NS1, foi utilizado para transformação de Agrobacterium tumefaciens e, posteriormente, de Nicotiana tabacum para expressão da proteína não-estrutural NS1. A extração do DNA e do RNA proveniente das plantas do tabaco foi realizada. A integração do gene da proteína NS1 no genoma vegetal e sua transcrição foram confirmadas por PCR. Análises subsequentes serão realizadas para verificar a expressão efetiva da mesma, que será purificada e concentrada.Item Identificação de genes expressos durante a fase pré-simbiótica da associação ectomicorrízica entre Hydnangium sp. e Eucalyptus grandis e transformação de fungos ectomicorrízicos(Universidade Federal de Viçosa, 2008-11-27) Coelho, Irene da Silva; Costa, Maurício Dutra; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728228J5; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4735662J0; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Cascardo, Júlio Cezar Mattos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723204T2; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4A expressão de genes do fungo ectomicorrízico Hydnangium sp. na fase pré-simbiótica foi avaliada utilizando-se a técnica de micorrização in vitro visando a construção de uma biblioteca subtrativa supressiva de cDNA. O fungo foi cultivado na presença de raízes de Eucalyptus grandis, sem, no entanto, haver contato direto das hifas com o sistema radicular da planta hospedeira. Foram identificados genes que codificam possíveis proteínas relacionadas com o metabolismo de carboidratos, de aminoácidos e energético, transcrição e síntese de proteínas, comunicação celular, transdução de sinal, resposta a estresse, transposons e proteínas relacionadas à biogênese de componentes celulares. A expressão dos genes que codificam piruvato desidrogenase, ATP sintase, proteína do canal seletivo de íon dependente de voltagem, acetil-CoA acetiltransferase e hidrofobina foi avaliada por RT-PCR quantitativo. A expressão diferencial destes genes durante a fase pré-simbiótica confirmou a ativação dos genes relacionados à beta-oxidação e ao metabolismo mitocondrial, além de validar a biblioteca subtrativa supressiva construída. A construção da biblioteca subtrativa de Hydnangium sp. possibilitará o estudo de diferentes genes relacionados à micorrização, auxiliando o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na associação ectomicorrízica. Para a transformação de Hydnangium com PEG/CaCl2 foi necessário otimizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos. A maior produção de protoplastos, 1,06 x 107 protoplastos/mL, foi obtida após duas horas em KCl 0,6 M, na presença de 20 mg/mL da preparação hidrolítica Lysing Enzymes e 0,3 g de micélio fúngico com dois dias de idade. Para regeneração de protoplastos foram testados diferentes estabilizadores osmóticos, concentrações de ágar no meio MNM e tempos de incubação da preparação hidrolítica. Entretanto, até o presente momento, não foram estabelecidas as condições que permitissem a regeneração dos protoplastos de Hydnangium sp. Para o estabelecimento da transformação de Hydnangium sp. mediada por Agrobacterium tumefaciens vários parâmetros foram testados, mas não foi possível a transformação desse fungo. Uma das razões desse insucesso pode ser devido a inibição da agrobactérias testadas pelo Hydnangium sp. A transformação do fungo ectomicorrízico Laccaria laccata mediada por A. tumefaciens foi estabelecida com uma eficiência de transformação de 32,6 %. A integração do gene hph no genoma das linhagens transformantes foi confirmada pela detecção de um fragmento de DNA de 690 pb que corresponde ao tamanho esperado. Os transformantes, com cópia única do T-DNA inserida no genoma, serão testados quanto à capacidade de formar micorrizas, visando a seleção de mutantes.Item Morfogênese in vitro e transformação genética de citros mediada por Agrobacterium tumefaciens(Universidade Federal de Viçosa, 2008-04-16) Oliveira, Maria Luiza Peixoto de; Finger, Fernando Luiz; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783681Y0; Costa, Márcio Gilberto Cardoso; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4762603P4; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4778992A7; Dias, José Maria Moreira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783068Z8; Picoli, Edgard Augusto de Toledo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4768537Z5; Motoike, Sérgio Yoshimitsu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728221T8Os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado numa baixa eficiência de transformação, com obtenção de pequeno número de plantas transgênicas, além de utilizarem material juvenil como fonte de explantes necessitando de um longo período para frutificação e conseguinte avaliação de uma característica de interesse introduzida. Um protocolo ideal para a transformação de citros seria baseado na utilização de tecido adulto como fonte de explantes, que reduziria o longo período de juvenilidade, e abreviria o tempo para a análise da característica transgênica incorporada. O objetivo inicial do presente trabalho foi o estabelecimento de um sistema de regeneração in vitro a partir de segmentos internodais de plantas adultas de três variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osb.) e limão Cravo (Citrus limonia Osb.), visando à otimização da metodologia de transformação. Para a indução de organogênese, investigamos diferentes meios de cultura associados a reguladores de crescimentos (BAP e ANA) e antibióticos β- lactâmicos (timentim, cefotaxima, meropenen e augmentina), utilizados na supressão do crescimento bacteriano e na resposta morfogênica de tecidos adultos de C. sinensis e C. limonia. Demonstrou-se que a indução in vitro de brotações em tecidos adultos de citros foi afetada pelo genótipo, reguladores de crescimento, formulação do meio e a pela incorporação de antibióticos no meio de cultura. Além disso, foram adequados protocolo otimizados para a transformação genética de segmentos de epicótilo e cotilédones imaturos via Agrobcaterium tumefaciens. Para a otimização do protocolo envolvendo explantes provenientes de segmentos de epicótilo, alguns fatores foram investigados, como; o uso de sonicação, infiltração a vácuo e sonicação associada com infiltração a vácuo, comparando-se ao método tradicional de transformação envolvendo Agrobacterium (co- cultivo ou imersão na solução bacteriana) durante o co- cultivo de explantes de laranja doce Pineapple , e citrumelo Swuingle . A utilização de sonicação por 2 segundos, seguidos por 10 minutos de infiltração a vácuo, teve efeito positivo na eficiência de transformação (8.4%) para laranja Pineapple . Para citrumelo Swuingle a eficiência de transformação também foi aumentada com a combinação de sonicação e infiltração a vácuo (9,6%), mas não foi suficiente para obter uma percentagem maior que a utilização somente da metodologia tradicional de co-cultivo, com eficiência de transformação de 11,2%. Finalmente, estudou- se fatores que pudessem influenciar o processo de indução da morfogênese e a eficiência de transformação em cotilédones imaturos de grapefruit Duncan . Para a indução da organogênese a combinação de 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA promoveu a maior freqüência de cotilédones produzindo brotações (96%) e número de brotações por explante (5,8), utilizando explantes cultivados dorsalmente em contato com o meio de cultura por 3 semanas no escuro, seguido por mais 3 semanas em regime de 16/8 horas (luz/ escuro). Os parâmetros analisados para aumentar a eficiência de transformação mediada por Agrobacterium resultaram em uma alta eficiência de transformação obtida quando os expantes foram submetidos a 15 minutos de infiltração a vácuo em presença da Agrobacterium (OD600nm 0,5), co- cultivados por 3 dias em meio contendo 100 μM de acetoseringona e transferidos para meio de seleção, constituído do meio MS contendo 30 mg l-1 de canamicina, 12,5 mg l-1 de meropenen, 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA.