Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Expressão heteróloga e caracterização bioquímica e biológica da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-18) Bastos, Matheus Silva e; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/1798823378041834; Fernandes, José Roberto Meyer; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720; Silva, Eduardo de Almeida Marques da; http://lattes.cnpq.br/9196320705613169A Leishmaniose Visceral (LV) é um grave problema de saúde pública em vários países do mundo incluindo o Brasil. Atualmente tem se observado um número crescente de casos no homem e no cão, sendo este último considerado principal reservatório doméstico responsável pela manutenção da doença em periferias de grandes cidades. O foco central deste trabalho é o estudo da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi, agente etiológico principal da LV no Brasil. A NTPDase-1 faz parte da família das E-NTPDases, que são enzimas implicadas como fatores de virulência de alguns parasitos. Elas participam da via de salvação de purinas e da modulação da resposta imune do hospedeiro dependente de nucleotídeos extracelulares. Essas enzimas constituem importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para as leishmanioses, tanto humana quanto canina. Neste trabalho foram feitas análises de bioinformática das E-NTPDases de Leishmania braziliensis, L. infantum, L. major, Trypanosoma brucei e T. cruzi. Além disto, foi feita a clonagem, expressão em sistema bacteriano, purificação e caracterização enzimática da porção solúvel da NTPDase-1de L. infantum chagasi. A enzima purificada foi usada também para produção de anti-soro policlonal anti-NTPDase-1. Foram feitos testes de crescimento de L. braziliensis, onde foi feito tratamento com a NTPDase-1 recombinante durante o cultivo celular. Nas análises de bioinformática foi possível observar a existência de dois grupos, as NTPDases-1 e NTPDases-2. Os dados demonstram que existem conservações específicas entre enzimas do mesmo grupo, como sítios de glicosilação e predição de localização subcelular onde a maioria das isoformas-1 são preditas como secretadas e as isoformas 2 como presentes na membrana. Foram observadas algumas possíveis pontes dissulfeto conservadas em todas as sequências. Quanto as características bioquímicas, baseado em dados já existentes, viu-se clara distinção de preferência por substrato entre as enzimas dos diferentes grupos, e duas enzimas (L.i NTPDase-2 e L. m NTPDase-2), muito próximas no agrupamento, apresentam hidrólise comum para a maioria dos substratos. Quando é comparada a NTPDase-1 de T. cruzi e a de L. infantum chagasi, caracterizada neste trabalho, observa-se que o pH de atividade máxima é distinto: a enzima de T. cruzi apresenta atividade maior em pH básico (7,5- 8) e a NTPDase-1 de L. infantum chagasi em pH ácido (5,5-6,0). A L. i NTPDase-1 apresentou especificidade para GTP enquanto as outras enzimas de tripanosomatídeos hidrolisam vários nucleotídeos tri e di-fosfatados. Nas análises o efeito biológico da adição da L.i NTPDase-1 em cultura axênica de promastigotas de L. braziliensis, verificou-se uma possível influência na metaciclogênese in vitro . Todos os dados são discutidos em termos de possíveis papéis da L.i NTPDase-1 na biologia de L. infantum chagasi e na infecção do vetor e do hospedeiro, abrindo novas perspectivas de estudos na área. Os dados obtidos sugerem que esta enzima pode influenciar de no mecanismo de metaciclogênese por algum processo ainda não conhecido.Item Expressão das NTPDases 1 e 2 de Leishmania infantum chagasi em sistema bacteriano e de célula de mamífero e estudo de suas influências na infecção de células raw 264.7 e na expressão de purino receptores P2(Universidade Federal de Viçosa, 2014-05-14) Bastos, Matheus Silva e; Lamêgo, Márcia Rogéria de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782197P4; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0; http://lattes.cnpq.br/1798823378041834; Fernandes, José Roberto Meyer; Afonso, Luis Carlos Crocco; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4789739U0; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Costa, Maximiller Dal-bianco Lamas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4133613H6A Leishmaniose Visceral (LV) é um grave problema de saúde pública em vários países do mundo incluindo o Brasil. Atualmente tem se observado um número crescente de casos no homem e no cão, sendo este último considerado principal reservatório doméstico, responsável pela manutenção da doença em periferias de grandes cidades. O foco central deste trabalho é o estudo das Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfo Hidrolase 1 e 2 de Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-1 e 2), agente etiológico principal da LV no Brasil. As LicNTPDases 1 e 2 fazem parte da família das E-NTPDases, que são enzimas implicadas como fatores de virulência de alguns parasitos. Evidências indicam que as E-NTPDases participam da via de salvação de purinas e da modulação da resposta imune do hospedeiro dependente de nucleotídeos extracelulares. Essas enzimas têm sido apontadas como importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para as leishmanioses, tanto humana quanto canina. Neste trabalho foram feitas análises comparativas da expressão destas enzimas em sistema bacteriano (pET21 b) e em células de mamífero (COS-7). Foram avaliados diferentes protocolos de renaturação, bem como feita a comparação entre a atividade das enzimas em diferentes substratos. Além disto, foi avaliado se as enzimas recombinantes podem participar do mecanismo de adesão dos parasitos em macrófagos e se estas e se estas são capazes de modular a expressão de purino receptores P2. Os resultados demonstram que alterando o protocolo de renaturação das enzimas expressas em bactéria, é possível aumentar a atividade da LicNTPDase-2, mas o mesmo efeito não foi observado para LicNTPDase-1. Já quando é feita a expressão em COS-7 é possível observar um aumento significativo da atividade da LicNTPDase-1. Por outro lado foi possível verificar o mesmo padrão de atividade entre a LicNTPDase-2 expressa em bactéria e expressa em COS-7 o que indica que a renaturação usada na LicNTPDase-2 expressa em E. coli é suficiente para atingir o estado nativo similar a que foi observada para a enzima expressa em célula de mamífero. ixEnsaios de adesão na presença em ausência das enzimas recombinantes levaram a uma diminuição da infecção em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Assim, foi possível confirmar a participação das LicNTPDases na adesão dos parasitos em macrófagos. Adicionalmente foi avaliado a expressão de mRNA de purino receptores P2 nos macrófagos RAW 264.7 na presença ou ausência das enzimas recombinantes. Foi possível verificar também a relação entre a presença destas enzimas e a modulação da expressão de alguns purino receptores P2, onde verificamos um aumento na expressão de P2X3, P2X5, P2Y2 e uma diminuição na expressão de P2Y13 para macrófagos incubados com LicNTPDase-1 e uma diminuição na expressão de P2X6 e P2X7 para macrófagos incubados com LicNPDase 2, quando os macrófagos foram infectados com Leishmania infantum chagasi, foi visto aumento na expressão dos receptores P2X2, P2Y12 e P2Y13, não foi possível verificar alterações para o restante dos receptores.