Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Identificação de GmERD 15, um novo fator de transcrição que controla a expressão do gene GmNRP-B em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-12) Alves, Murilo Siqueira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8216921216597311; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5Recentemente foi demonstrado através de experimentos de microarranjos de DNA que as vias de resposta aos estresses no retículo endoplasmático e osmótico convergem aumentando a expressão de um conjunto de genes coordenadamente regulados, dentre eles o gene GmNRP-B codifica uma proteína rica em asparagina e que está envolvida com eventos de morte celular programada em plantas. Este trabalho teve como objetivo principal a identificação e caracterização de fatores de transcrição que controlam a expressão de GmNRP-B, e que portanto constitui um importante componente da via integrativa dos estresses do retículo e osmótico. Para tanto a região promotora de GmNRP-B foi identificada em banco de dados e a partir dela foram construídas fusões de transcrição com os genes repórteres HIS3 e LacZ. Estas construções foram integradas no genoma de leveduras W303, resultando nos transformantes W303-pNRP-His/LacZ, que foram utilizadas como hospedeiras para transformação com uma biblioteca de cDNA de soja construída no vetor pEXP-AD502. Após a varredura da biblioteca, foram selecionados 9 clones, destes 9 apenas um manteve-se positivo após um novo evento de transformação. O sequenciamento do DNA do clone positivo e a comparação de sua seqüência com o banco de dados do Phytozome identificou um gene que codifica uma proteína similar a ERD15 de Arabidopsis. O gene de soja identificado foi denominado GmERD15 e a seqüência de aminoácidos deduzida mostrou que a proteína possui um domínio conservado de interação com proteínas que se ligam à cauda poli A de mRNAs (PABP). A busca por seqüências similares no banco dedados do Phytozome mostrou que o gene encontra-se duplicado no genoma da soja e que além dos dois genes outros 4 constituem esta família gênica em soja. A comparação da seqüência de aminoácidos deduzida com ortólogos ERD15 de diversos organismos mostrou que GmERD15 possui o domínio de interação com PABP conservado em sua porção amino-terminal e uma porção carboxi terminal divergente. A análise do agrupamento destas proteínas mostrou que podemos dividir esta família de proteínas em pelo menos 3 subfamílias sendo que GmERD15 encontra-se em uma subfamília separada da proteína de Arabidopsis. Para confirmar a interação da proteína GmERD15 com a região promotora de GmNRP-B foram realizadas deleções a partir do nucleotídeo -1000 do início de tradução originando fragmentos com 700 e 350 pares de bases. A análise destes promotores por monohíbrido em leveduras mostrou que esta proteína ativa fortemente a expressão de LacZ sob controle do promotor de GmNRP-B de 1000 e 700 pares de bases, porém esta ativação decai consideravelmente quando o promotor é deletado até aproximadamente 350 pares de bases, indicando uma grande perda de cis-elementos. Foi constatado também que GmERD 15 possui atividade de transativação em leveduras. Além disto a análise da sequência de aminoácidos mostrou a presença de um domínio de ativação transcricional na porção carboxi-terminal, e a expressão transiente de GmERD 15 em protoplastos de soja levou a um aumento da expressão de GmNRP-B. Quimeras de GmERD 15 com a proteína YFP expressas transientemente em folhas de tabaco localizam-se no citosol e no núcleo. Coletivamente, estes resultados indicam que GmERD 15 atua no controle da expressão do gene GmNRP-B revelando uma nova família de transfatores, que atuam nocontrole da expressão de genes em plantas.Item Caracterização bioquímica e funcional de fatores de transcrição envolvidos na resposta a estresses biótico e abiótico em soja(Universidade Federal de Viçosa, 2013-09-02) Alves, Murilo Siqueira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8216921216597311; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9; Cunha, Luis Claudio Vieira da; http://lattes.cnpq.br/9367947173322278; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/1153853218347720As respostas a estresses ambientais em plantas culminam em uma drástica reprogramação da expressão gênica favorecendo respostas moleculares a estresses em detrimento das funções celulares normais. Fatores de transcrição são reguladores fundamentais da expressão gênica a nível transcricional, e o controle de suas atividade altera o transcriptoma da planta, determinando mudanças metabólicas e fenotípicas em resposta ao estresse. Análises funcionais de fatores de transcrição são, portanto, muito importantes para a elucidação do papel destes reguladores transcricionais em diferentes cascatas de sinalização. Neste estudo, nós descrevemos a caracterização funcional de fatores de transcrição nas respostas moleculares durante estresses ambientais, tais como estresses no retículo e estresse osmótico, e durante ataque de patógenos. No primeiro capítulo, nós descrevemos um novo fator de transcrição, GmERD15 (Glycine max Early Responsive to Dehydration 15), o qual é induzido por estresse no retículo e osmótico para ativar a expressão de genes NRP (Asparagine-rich protein). No segundo capítulo, descrevemos a identificação de quatro fatores bZIP de soja, GmbZIP62, GmbZIP105, GmbZIPE1 e GmbZIPE2, responsivos à infecção por Phakopsora pachyrhizi, agente causador da ferrugem asiática. O conhecimento das funções destes fatores de transcrição em cascatas de sinalização de respostas a estresses é crucial para a manipulação da tolerância a estresses em cultivares de importância agronômica, e consequentemente determinará o desenvolvimento de variedades de cultivares geneticamente manipulada com melhorada tolerância a estresses.