Ciências Biológicas e da Saúde
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Item Indução do mecanismo de quorum sensing por autoindutor-1 em Salmonella enterica e prospecção de inibidores(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-26) Almeida, Felipe Alves de; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/6974373348701815O mecanismo de quorum sensing em Salmonella pode ser mediado por três tipos de autoindutores (AI), denominados AI-1, AI-2 e AI-3. Contudo, o mecanismo por AI-1 neste patógeno é incompleto, pois não há síntese do AI-1, denominado acil homoserina lactona (AHL). Porém, Salmonella possui a proteína SdiA, homóloga a proteína LuxR, que permite detectar as AHLs produzidas por outras bactérias. A influência da AHL sobre a expressão de genes específicos de Salmonella, como os genes do operon rck e outros genes de virulência é reconhecida. Entretanto, poucos são os estudos que avaliaram a resposta global de Salmonella na presença de AHLs exógenas. Assim, os objetivos do presente estudo foram avaliar a influência da AHL sobre a resposta global de Salmonella, bem como avaliar a ligação destes AIs-1 à proteína SdiA e realizar a prospecção, in silico, de inibidores do mecanismo de quorum sensing por AI-1 em Salmonella. As análises globais dos perfis de proteínas, ácidos graxos e ácidos orgânicos extracelulares ao longo do tempo de cultivo de Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 em anaerobiose na presença e ausência de N-dodecanoil homoserina lactona (C12-HSL), mostraram que estes perfis foram alterados na presença do AI. Além disso, os perfis de proteínas e ácidos graxos variaram menos ao longo do tempo de cultivo na presença de C12-HSL, ou seja, células cultivadas por 4 h (fase logarítmica) e por 36 h (fase estacionária) na presença do AI-1 apresentaram perfis de ácidos graxos e proteínas menos dispersos em comparação ao controle sem AHL, onde foi detectada grande variação destes perfis. Estes resultados indicam que as células na presença de C12-HSL estão mais preparadas para os estresses de fase estacionária, por haver a antecipação das alterações celulares que ocorrem nesta fase. Outro fato constatado é que as proteínas relacionadas ao processo de oxirredução, principalmente proteínas tiol, e a quantidade de tiol celular livre foram maiores em células cultivadas na presença de C12-HSL, indicando que este patógeno está mais preparado para uma possível condição de estresse oxidativo. A proteína SdiA de Salmonella Enteritidis foi modelada e verificou-se que as AHLs com cadeia acila mais longas têm mais afinidade a esta proteína, principalmente as AHLs com 12 carbonos. Além disso, as furanonas que são conhecidos inibidores do mecanismo de quorum sensing, também foram capazes de ligar a SdiA de Salmonella com alta afinidade nas análises in silico. A prospecção de inibidores entre compostos de planta e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) por docking molecular também mostrou que a maioria dos compostos analisados foi capaz de ligar a proteína SdiA de Salmonella, com destaque para o Z-fitol e o lonazolaco. Os resultados do presente trabalho indicam caminhos para determinar as vias e, ou macromoléculas chaves do metabolismo influenciadas pelo mecanismo de quorum sensing por AI-1 em Salmonella. Além disso, os resultados obtidos in silico indicam potenciais compostos inibidores do quorum sensing para serem avaliados in vitro.Item Influência do quorum sensing na formação de biofilme e no perfil de expressão de proteínas de Salmonella enterica sorovar Enteritidis(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-27) Almeida, Felipe Alves de; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/6974373348701815Quorum sensing (QS) é um mecanismo de comunicação entre células microbianas mediado por moléculas sinalizadoras, denominadas autoindutores (AIs). Embora não produza o AI-1, que são moléculas de acil homoserina lactonas (AHLs), Salmonella responde às AHLs produzidas por outros micro-organismos por sintetizar a proteína de resposta ao AI-1, denominada de SdiA. Contudo, o gene sdiA ainda não tem sua função estabelecida em Salmonella. Neste trabalho foi avaliada a influência de n-dodecanoil homoserina lactona (C12-AHL) e de furanonas, análogas de AHLs, sobre o crescimento, motilidade, adesão, formação de biofilme em poliestireno e síntese de proteínas por Salmonella Enteritidis PT4 em anaerobiose. Na presença ou na ausência de 50 nM de C12-AHL e, ou de furanonas, o crescimento, a motilidade em massa ou por espalhamento (swarming) e a motilidade por contração ou por espasmos (twitching) deste patógeno não foram alterados. Conforme verificado pela determinação do potencial de adesão e formação de biofilme em microplacas, enumeração de células aderidas e microscopia confocal de epifluorescência, foi constatada que a presença de C12-AHL induziu a formação de biofilme em superfície de poliestireno após 36 h de cultivo. Além disso, constatou-se o efeito antagonista das furanonas sobre a formação de biofilme nas mesmas condições. As proteínas sintetizadas por Salmonella Enteritidis PT4 na presença e na ausência de 50 nM de C12-AHL após 7 h de cultivo em anaerobiose foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional e preditas por comparação do ponto isoelétrico e massa molecular disponíveis em bancos de dados. Foi verificado que, na presença de C12-AHL houve síntese de maior número de proteínas, sendo que muitas delas estão relacionadas com o sistema QS e com a formação de biofilme. Os resultados obtidos evidenciam que a presença de C12-AHL exógena influencia o metabolismo de Salmonella Enteritidis PT4, cultivada em condições de anaerobiose e indicam uma nova linha de investigação que pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos relacionados com a patogenicidade de Salmonella.