Genética e Melhoramento
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Item Caracterização de seqüências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-16) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8; http://lattes.cnpq.br/6208150945096223; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Silva, Felipe Rodrigues da; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4733948J9Seqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como iscas para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.Item Caracterização funcional e identificação de SNPs e de genes de resistência a doenças do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-18) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Caixeta, Eveline Teixeira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728636Z7; Zambolim, Eunize Maciel; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783380J6; Sakiyama, Ney Sussumu; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781483H8; http://lattes.cnpq.br/6208150945096223; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782432A8; Zambolim, Laércio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787254T6; Oliveira, Antônio Carlos Baião de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4782833P5O Projeto Brasileiro do Genoma Café gerou um banco de dados de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Estas sequências estão armazenadas no banco de dados do Projeto, o CafEST. Em trabalho anterior, foi realizada análise in silico das sequências do CafEST, a qual permitiu a identificação de 14.060 sequências relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças. Dessas 14.060, 1.855 foram sequências cujos produtos preditos eram quitinases. Dada a importância das quitinases, tanto na interação planta-patógeno, como em outros processos da planta, as ESTs de quitinase foram detalhadamente analisadas no presente trabalho. Para isso foi realizada uma caracterização funcional e construído um perfil de expressão in silico. A categorização funcional foi feita com o software Blast2GO e o perfil de expressão gênica in silico foi determinado por meio de análises de Northern Blot Virtual. Os resultados da caracterização funcional mostraram a versatilidade das quitinases, que possuem atividade enzimática e estão envolvidas em importantes processos biológicos e funções moleculares nas células da planta. A análise do perfil de expressão in silico permitiu verificar que as quitinases estão mais expressas, principalmente, em bibliotecas que apresentam algum componente de estresse. Para selecionar, entre as 14.060 sequências mineradas, aquelas que estão envolvidas com a resistência do cafeeiro à ferrugem, foram desenvolvidos, em trabalho anterior, 40 pares de primers. Os primers foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo que um deles foi polimórfico entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis. No presente trabalho, 15 primers monomórficos foram escolhidos para análises de polimorfismos de base única (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) nas sequências de DNA entre os 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. As sequências obtidas foram analisadas com os programas Sequencher® v. 4.10, ORF Finder, BLAST e ClustalW. Dos 15 genes, quatro não apresentaram nenhum SNP. Cinco genes apresentaram SNPs, mas os polimorfismos foram observados apenas para o clone da espécie Coffea liberica var. dewevrei (café excelsa). Os outros seis genes foram polimórficos entre os genótipos amostrados. Foram detectados 71 SNPs, sendo que 34 foram transições (47,89%) e 37 transversões (52,11%). A taxa de transições/ transversões foi de 0,9189. Das 71 substituições, 27 ocorreram na primeira posição do códon (38,02%), 15 na segunda posição (21,12%) e 29 na terceira (40,84%). Foram detectadas 11 (15,49%) substituições sinônimas e 60 (84,51%) substituições não sinônimas. A relação de substituições sinônimas/não sinônimas foi de 0,1833. Um alto nível de mutações não sinônimas, como o que foi encontrado neste trabalho, pode ser reflexo de seleção positiva. Um exemplo é o cenário antagonista da coevolução patógeno-hospedeiro, onde os genes do hospedeiro estão engajados numa corrida armamentista evolucionária e sob forte pressão de seleção para mudarem e se adaptarem. Em função disso, eles evoluem numa taxa mais rápida que outros genes. Este cenário pode ser aplicado ao presente trabalho, dado o alto nível de modificações não sinônimas detectado e ao fato que os genes analisados atuam, de alguma forma, no processo de defesa do cafeeiro contra patógenos. Foi observada uma frequência de 0,1029 SNPs por amplicon. Nos 119.061 pb analisados detectou-se uma frequência extremamente baixa de 1 SNP a cada 1.676,91pb, ou de 0,0596 SNPs por 100 pb. Pode-se atribuir o baixo nível de polimorfismo observado à baixa diversidade do genoma de C. arabica. A análise dos produtos gênicos permitiu verificar que as mutações não sinônimas identificadas não levaram à formação de proteínas preditas distintas. No presente trabalho foi também iniciada a clonagem de um gene potencialmente envolvido com a resistência do cafeeiro a ferrugem. Em trabalho anterior, foi identificado um fragmento de gene de resistência, amplificado pelo primer CARF 005, presente nos indivíduos resistentes e ausente nos susceptíveis à ferrugem do cafeeiro. Esse primer foi utilizado no presente trabalho para realizar um screening de uma biblioteca de BACs (Bacterial Artificial Chromosome Cromossomo Artificial de Bactéria) contendo 56.832 clones Na identificação do(s) clone(s) positivo(s), utilizou-se o método de decomposição de pools. Foram identificados dois clones positivos (i. e. dois clones contendo fragmento de gene de resistência amplificado pelo marcador CARF 005). Os dados de sequenciamento dos dois clones identificados poderão fornecer informações importantes sobre a estrutura dos genes de resistência em Coffea.