Genética e Melhoramento
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Item Mecanismos de resistência contra geminiviroses e o potencial do mutante duplo de NIK1, NIK1-T469A/T474D, em conferir resistência em tomateiros(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Loriato, Virgilio Adriano Pereira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4655674526261584A família Geminiviridae é uma das maiores e mais bem-sucedidas famílias de vírus de plantas que infecta uma grande variedade de culturas agronomicamente importantes, tanto dicotiledóneas quanto monocotiledóneas, e causa perdas significativas de produtividade mundialmente. Este amplo espectro de gama de hospedeiros só é possível porque os geminivírus desenvolveram estratégias sofisticadas para superar o arsenal de defesas antivirais em espécies vegetais tão diversas. Além disso, os geminivírus evoluem rapidamente através de recombinação ou pseudo-recombinação para criar naturalmente uma grande diversidade de espécies de vírus com sequências de genoma divergentes, dando ao vírus uma vantagem sobre o sistema de reconhecimento do hospedeiro. Portanto, não é surpreendente que estratégias moleculares eficientes para combater a infecção por geminivírus, em condições de campo aberto, não tenham sido totalmente desenvolvidas e abordadas experimentalmente. No primeiro capítulo, foi discutido o arsenal anti-geminiviral das defesas de plantas, as estratégias de virulência evoluídas dos geminivírus para superar essas defesas de plantas e as estratégias mais recentes que foram projetadas para resistência transgênica. No segundo capítulo, foi determinado experimentalmente a eficiência da resistência contra begomovírus que infectam tomateiros, derivada da manipulação in vitro da atividade da sinalização antiviral mediada por NIK1 [“nuclear shuttle protein (NSP)-Interacting Kinase 1]. Epidemias associadas a begomovírus atualmente ameaçam a produção mundial de tomate devido ao surgimento de espécies de vírus altamente patogênicas. Mais de dez espécies diferentes de begomovírus que infectam tomateiros foram identificadas e caracterizadas em território brasileiro na última década. A sinalização antiviral mediada por NIK1 é ativada pela infecção viral e protege as plantas contra begomovírus em interações incompatíveis, mas é superada pelo supressor viral NSP de NIK1, em interações compatíveis. A fosforilação em Thr-474 é o evento crucial que desencadeia a ativação de NIK1. A construção de um mutante de ganho de função, substituindo o resíduo Thr-474 pelo resíduo fosfomimético Asp, aumentou a resistência contra begomovírus em linhagens de tomateiro transgênico. Para gerar uma estratégia de resistência eficiente contra begomovírus, uma segunda mutação em T474D foi introduzida pela substituindo do resíduo Thr-469 por Ala e, assim, eliminando o efeito antagonista da fosforilação em Thr-469. O mutante duplo ivT469A/474D apresentou maior atividade de fosforilação in vitro em comparação com NIK1 e T474D. Os ensaios funcionais foram realizados usando linhagens de tomate transgênico transformadas com uma construção de DNA expressando T469A / T474D fusionado a GFP sob o controle do promotor 35S. As mutações duplas em NIK1 promoveram a ativação constitutiva das defesas mediadas por NIK1, mesmo em baixos níveis de expressão do transgene, resultando na repressão dos genes da proteína ribossomais, marcadores moleculares da ativação da sinalização antiviral. Além disso, as linhagens transgênicas apresentaram resistência aumentada ao begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV), um fenótipo associado à ausência de sintomas, baixa eficiência da taxa de infecção e reduzido acúmulo de DNA viral nas folhas sistêmicas. Estes resultados confirmam o efeito antagonista da fosforilação em Thr-469 e Thr-474 na ativação da sinalização antiviral mediada por NIK1, indicando que, provavelmente, a fosforilação em Thr-469 regula negativamente a ativação de NIK1 para prevenir a autoimunidade.