Genética e Melhoramento
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Item Caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum: análise do cariótipo, da expressão dos genes plg 1 e pgg 2 e da produção de pectina liase e poligalacturonase em resposta ao pH do meio(Universidade Federal de Viçosa, 2011-05-23) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4; Castro, Ieso de Miranda; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798Os estudos genéticos e fisiológicos realizados com o isolado Penicillium griseoroseum CCT6421 ressaltam as vantagens para a sua aplicação como hospedeiro para produção de proteínas. A obtenção e análise de linhagens recombinantes de P. griseoroseum com alta produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) evidenciaram o eficiente sistema de secreção desse fungo, indicando a possibilidade de utilização deste como plataforma para produção de proteínas de interesse industrial. Entretanto, pouco é conhecido sobre a organização do genoma de P. griseoroseum e das linhagens recombinantes. Neste trabalho foi estimado o tamanho do genoma de P. griseoroseum entre 29,8 e 31,0 Mb, distribuídos em quatro cromossomos. O gene plg1, que codifica PL, está em cópia única no genoma de P. griseoroseum e foi localizado no cromossomo II (9,22 Mb). A linhagem recombinante T105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor de gpd de Aspergillus nidulans, apresentou integrações nos cromossomos II, III e IV. As linhagens recombinantes T146 e T20 possuem, respectivamente, cópias adicionais do gene pgg2 e dos genes pgg2 e plg1, sob o controle do promotor de gpd de A. nidulans. O gene pgg2 codifica PG em P. griseoroseum. A análise da expressão dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes de P. griseoroseum multi-cópias, mostrou que o aumento do número de cópias dos genes proporciona o aumento da produção enzimática. Uma cópia do gene plg1, sob o controle do promotor constitutivo, proporcionou um aumento de 200 vezes na expressão em relação ao gene endógeno e duas cópias do gene pgg2, também sob o controle do promotor constitutivo, proporcionaram um aumento de 1100 vezes na expressão em relação ao gene endógeno. A produção e secreção de PL e PG pelas linhagens recombinantes T105, T146 e T20 de P. griseoroseum são afetadas pelas condições de cultivo. As linhagens foram cultivadas em meio tamponado MMT (pH 6,8) e em meio não-tamponado MMNT (pH 6,3 3,0), para verificar a expressão dos genes plg1 e pgg2, produção e secreção de PL e PG em diferentes tempos de cultivo. A transcrição dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes, é constitutiva e não foi detectado variação em ambos os meios. No entanto, a quantidade de proteína total secretada variou em média 7,8 ± 1,1 μg/mL no meio MMT e 3,25 ± 1,50 μg/mL no meio MMNT. A análise por SDS-PAGE das proteínas do sobrenadante da cultura das linhagens possibilitou verificar uma maior quantidade de PL e PG secretada no meio MMT do que no meio MMNT. A secreção de PL e de PG foram afetadas pela variação do pH do meio, apresentando reduções nas atividades de 6,4 e 3,6 vezes, respectivamente, para a atividade detectada em meio MMNT em comparação ao meio MMT. A variação do pH do meio também alterou a morfologia da hifa e do micélio da linhagem recombinante T20, o que pode estar relacionado com a redução da secreção de PL e PG. Os resultados mostram que a maquinaria de transcrição, tradução e secreção de proteínas do fungo P. griseoroseum responde ao aumento do número de cópias de genes no genoma, observando-se as condições de cultivo.Item Mapeamento de loco de resistência à Puccinia psidii em Eucalyptus sp. por meio de marcadores moleculares microssatélites(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-18) Tomaz, Rafael Simões; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Carneiro, Pedro Crescêncio Souza; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728227T6; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7689901086405263; Rosado, Antonio Marcos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795474A4; Abad, Júpiter Israel Muro; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767878A3A ocorrência da ferrugem causada pelo fungo Puccinia Psidii pode representar um fator limitante para as plantações de eucalipto. O plantio de genótipos resistentes a esse fungo é a medida mais adequada de controle dessa doença. Neste sentido, o estudo e a detecção de genes responsáveis pela resistência a este patógeno, permitindo a seleção precoce de genótipos resistente, é desejável. Desta forma, este trabalho objetiva a detecção e o mapeamento de locos de resistência ao patógeno Puccinia Psidii em um cruzamento interespecífico de Eucalyptus sp. por meio de marcadores moleculares microssatélites. Foi utilizada a informação fenotípica da progênie de 117 indivíduos resultante do cruzamento de um genitor feminino E. grandis resistente ao patógeno e um genitor masculino híbrido entre E. urophylla e E. grandis susceptível e a informação genotípica de 22 marcadores microssatélites. A detecção de QTL controlador da característica foi realizada por meio da metodologia da ANOVA, regressão de Haseman & Elston, original e modificada, ponderada pela informatividade do marcador, e regressão de Fulker & Cardon. As análises de marca simples detectaram associação significativa para os marcadores EMBRA 125 e EMBRA 321, ambos do grupo de ligação três do Eucalyptus. A regressão de Haseman e Elston apresentou valores de pF = 20,6515 e H2 = 14,73% para o marcador EMBRA 125 e pF = 70,1694 e H2 = 40,58 para o marcador EMBRA 321. Adicionalmente, a metodologia de Fulker e Cardon permitiu a detecção do QTL, com valor de pF de 29,4788 e H2 de 17,58%. O loco QTL foi posicionado a 0,01cM do marcador EMBRA 125. O marcador EMBRA 321 não pôde ser avaliado por meio da metodologia de intervalo. A aplicação dos marcadores EMBRA 125 e EMBRA 321 em procedimentos de seleção assistida é putativa e deve ser investigada.Item Morfologia da ectomicorriza Scleroderma laeve - Eucalyptus grandis e análise da expressão do gene que codifica a subunidade seis de ATP sintase(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-19) Betancourth, Blanca Mercedes Leguízamo; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721444T5; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7225774367814940; Otoni, Wagner Campos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4786133Y6; Gomes, Eliane Aparecida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723848T1; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4Scleroderma laeve é um fungo Basidiomiceto capaz de formar ectomicorrizas com Eucalyptus grandis. Foi observado aumento significativo do número de raízes laterais em plântulas de E. grandis em contato com S. laeve durante a fase de préinfecção em relação às plântulas não inoculadas. A inoculação com S. laeve também aumentou o número de raízes laterais em plântulas de E. grandis durante as etapas de colonização, diferenciação e funcionamento em relação às plântulas não inoculadas. No terceiro dia de contato entre o fungo e a planta, foi observado alongamento parcial das células da epiderme e formação do manto fúngico e no 15º dia foi observada a iniciação da formação da rede de Hartig. No trigésimo dia, o número de raízes laterais nas plântulas em contato com o fungo foi quatro vezes maior do que nas plântulas controle. Ocorreu, ainda, alongamento das células da epiderme e engrossamento do manto. As raízes laterais emergentes que formavam as ectomicorrizas não apresentavam pêlos radiculares, estavam totalmente envolvidas pelo manto fúngico e possuíam a rede de Hartig completamente formada entre as células alongadas da epiderme. Utilizando o sistema in vitro foi possível acompanhar, retirando-se raízes laterais e ectomicorrizas em diferentes estádios, as mudanças morfológicas da simbiose e de expressão do gene que codifica a subunidade seis de ATP sintase em S. laeve. A seqüência parcial do gene obtida possui 503 pb, na qual não foi observada a presença de introns. Essa sequência apresentou identidade com as sequências dos genes que codificam a subunidade seis de ATP sintase em S. hypogaeum, Pisolithus arhizus, Gyroporus cyanescens, entre outros, confirmando o parentesco entre esses organismos. A análise da expressão do gene que codifica a subunidade seis de ATP sintase em S. laeve por RT-PCR, nas diferentes etapas da associação, mostrou que esse gene é expresso em todas as etapas da micorrização.Item Obtenção e caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum com alta produção de pectina liase e poligalacturonase(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-12) Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://lattes.cnpq.br/7776451670494630; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6; Tótola, Marcos Rogério; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727020U4Penicillium griseoroseum foi descrita como uma espécie promissora para a produção de poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL). No entanto, os genes que codificam estas enzimas em P. griseoroseum requerem indução por pectina e sofrem repressão catabólica na presença de glicose. Uma estratégia para aumentar a expressão destes genes é a substituição do promotor endógeno por um promotor forte e constitutivo. Desse modo, para se obter linhagens com alta produção de poligalacturonase e pectina liase, sem a necessidade de indução, foi feita a co-transformação da linhagem recombinante 105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor do gene gpd de A. nidulans, utilizando-se os plasmídeos pAN52pgg2 e pAN7.1. As linhagens recombinantes obtidas apresentaram, pelo menos, uma cópia do pAN52pgg2 integrada no genoma. A linhagem mitoticamente estável, denominada recombinante R20 de P. griseoroseum, foi selecionada por apresentar a maior produção de PG e PL em comparação com as demais linhagens recombinantes obtidas. Esta linhagem apresentou uma elevada produção de poligalacturonase e pectina liase, quando cultivada em presença de glicose, sacarose ou caldo de cana. Aumentos de 11 vezes na atividade de PG e de 45 vezes na atividade de PL ocorreram, quando a linhagem recombinante R20 foi cultivada em caldo de cana, em relação à linhagem selvagem cultivada em condições ótimas de produção. A maior produção de PG, PL e massa micelial seca pela linhagem recombinante R20 foi obtida, quando se utilizou inóculo de 106 conídios/mL, concentração de glicose 1% (p/v), volume de 200 mL de meio de cultivo em Erlenmeyers de 500 mL e tempo de cultivo de 72 a 96 horas, sob agitação de 150 RPM a 25ºC. No perfil protéico da linhagem recombinante R20 evidenciou-se a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, que correspondem a PG e a PL, respectivamente. A linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo, enquanto a atividade celulolítica não foi detectada nas condições avaliadas. Além disso, a linhagem recombinante R20 teve uma secreção de 18 mg de proteína total/L em 120 horas de cultivo, sendo pectina liase e poligalacturonase preferencialmente secretadas. Os resultados são úteis para a condução de experimentos de otimização em larga escala e posterior aplicação da linhagem recombinante R20 na indústria de produção de pectinases.Item Proposta de metodologia para mapeamento de locos controladores de características oligogênicas(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-30) Rocha, Rodrigo Barros; Cruz, Cosme Damião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4788274A6; Barros, Everaldo Gonçalves de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781285J6; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4775533A1; Martins Filho, Sebastião; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723282T5; Abad, Júpiter Israel Muro; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767878A3Características oligogênicas se caracterizam por sua herança governada por genes de maior efeito e por sua importância para as espécies vegetais cultivadas, com destaque para a resposta de resistência das plantas às doenças. A natureza discreta e a interação epistática destas características resultam em um padrão de herança que não deve ser interpretado pelos métodos tradicionais de detecção de QTL. A busca por métodos que permitam melhor interpretar a informação genética produzida durante a recombinação continua sendo um dos principais objetivos do mapeamento e identificação de QTLs. O objetivo deste trabalho é o de propor um método para mapeamento e detecção de locos controladores da expressão de características oligogênicas, OTLs ( Oligogenic Trait Loci ). Este método definido como M.M.C.O (Método de Mapeamento de Características Oligogênicas) utiliza de funções de verossimilhança para obtenção de estimativas de recombinação r de melhor ajuste aos dados, a partir das probabilidades condicionais de ocorrência entre o loco marcador e a herança da característica oligogênica. Os resultados mostram que o método foi adequado para detecção de OTLs em populações de retrocruzamento e em populações F2. Análises comparativas entre as metodologias mostram que as estimativas M.M.C.O. de r entre o loco marcador e os locos OTLs são mais precisas do que as obtidas pelos métodos de marca simples e de intervalo simples. A necessidade de conhecer previamente o padrão de herança da característica é uma das maiores limitações no estudo das características oligogênicas; e a definição não apropriada do padrão de herança resulta em uma diminuição no poder de teste da metodologia. O M.M.C.O. não necessita de informação prévia de ordenamento dos marcadores e não é influenciado pela ocorrência OTLs em um mesmo grupo de ligação. O atendimento das pressuposições para análise das características oligogênicas, a maior acurácia das estimativas, obtidas a partir da informação contida em todas as classes genotípicas, e a possibilidade de posicionar pontualmente o OTL fazem do M.M.C.O. uma estratégia de potencial para contribuir na interpretação da herança de características oligogênicas.