Agroquímica
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Item Efeito do ácido jasmônico na síntese de lipoxigenase e de inibidores de proteases em sementes de explantes de soja(Universidade Federal de Viçosa, 1999-10-20) Carli, Alessandra de Paula; Moreira, Maurílio Alves; http://lattes.cnpq.br/7249414583814378Este trabalho consistiu em utilizar o sistema de cultivo de explantes de soja para estudar o efeito do ácido jasmônico, no sistema “in vitro”, em sementes de linhagens normais e com ausência de lipoxigenases, derivados das variedades CAC-1, Itamarati e Cristalina na síntese de lipoxigenases (LOX) e do inibidor de protease Kunitz (KTI). Ácido jasmônico foi adicionado aos meios de cultivo em que os explantes foram cultivados. As avaliações basearam-se nos efeitos do ácido jasmônico sobre o conteúdo do inibidor de tripsina Kunitz (KTI) e da atividade específica de LOX1 e LOX 2 e 3. Os explantes foram cultivados em meios de cultura líquidos, sob condições semi- assépticas, os quais continham nutrientes minerais, glutamina e sacarose. O pH da solução nutritiva foi mantido em torno de 5,0. Cada explante constou de uma vagem completamente expandida, com duas sementes de, aproximadamente, 100 mg, conectada a um segmento de caule de 45 mm de comprimento. Os explantes foram excisados a partir do quinto nó, da base para o ápice. Os tratamentos testados foram: A = 0, B = 200 e C = 400 μM de ácido jasmônico. O experimento foi conduzido sob irradiância de 80 umol de fótons m-2s-1 a 25oC, por 8 dias. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com quatro repetições. Os resultados obtidos evidenciaram que nos tratamentos que receberam ácido jasmônico notou-se um aumento significativo da atividade específica de LOX e no conteúdo de KTI em sementes de variedades normais. No entanto, em explantes de linhagens triplo-nulas (desprovidas de LOX), o ácido jasmônico não aumentou o conteúdo de KTI. Estes resultados sugerem, fortemente, que a síntese de inibidores de proteases em sementes de soja é induzida por ácido jasmônico via indução da síntese de lipoxigenases e que, em sementes triplo nulas esse efeito não é observado devido à ausência completa de lipoxigenases.Item Caracterização da “via das lipoxigenases” em plantas de soja submetidas ao ataque de insetos-praga(Universidade Federal de Viçosa, 1999-03-05) Silva, Francine Barbosa; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/8372569217064422Lipoxigenases (EC: 1.13.11.12) são enzimas que catalisam a dioxigenação estereoespecífica de ácidos graxos polinsaturados que contêm o sistema cis,cis-1,4-pentadieno, formando hidroperóxidos que são posterior- mente metabolizados e produzem substâncias com atividades fisiológicas pronunciadas. As LOXs são responsáveis pela formação de compostos orgânicos responsáveis pelo “beany flavor” das sementes de soja, que reduz drasticamente a utilização desta oleaginosa na alimentação humana. Uma estratégia na eliminação deste sabor indesejável é a retirada, através de manipulação genética, das LOXs de semente. Além disso, é descrito o envolvimento dessas isoenzimas no crescimento e desenvolvimento, na senescência e na biossíntese de moléculas regulatórias. Este trabalho avaliou a capacidade da planta em responder ao ataque de insetos-praga (um mastigador e outro sugador) pela “via das lipoxigenases”, tendo sido realizadas análises bioquímicas e cinéticas do “pool” de lipoxigenases foliares e dos possíveis produtos finais da via. Foram utilizados dois genótipos de soja: um normal (variedade IAC-100) e outro com ausência completa de lipoxigenases nas sementes (linhagem IAC-100 TN). As plantas foram submetidas a uma população de insetos-praga (lagarta da soja ou mosca-branca) em gaiolas de filó. Para lagarta da soja, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 6, 12 e 24 horas após o ataque da planta pelo inseto. A seguir o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. No caso da mosca-branca, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 12, 24, 48 e 72 horas após o ataque da planta pelo inseto. Em seguida o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. Os resultados das análises bioquímico-cinéticas revelaram dois picos mais acentuados de atividade e atividade específica de lipoxigenases a pH 4,5 e 6,0 nos dois tratamentos, com temperatura ótima de atividade e atividade específica a 25 oC. Para ambos os genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos do que nos respectivos controles. Para a lagarta da soja, os valores de KM aparente, determinados no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados, diminuíram a partir de 6 até 24 horas, em presença do inseto, e de 6 até 48 horas, após remoção do inseto. Para a mosca-branca, os valores de KM aparente no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados decresceram com o tempo de ataque, ou seja, de 12 até 72 horas, em presença do inseto; após a remoção do inseto, estes valores voltaram a aumentar. A variação no valor de KM aparente para ambos os genótipos sugere uma alteração do “pool” de lipoxigenases em resposta ao ataque de insetos. Tanto no experimento com lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis Hübner) quanto naquele com mosca-branca (Bemisia argentifolii), observou-se aumento significativo na produção de inibidores de proteases após a remoção dos insetos, para ambos os genótipos analisados. Esses resultados, aliados aos dados obtidos para as constantes cinéticas, reforçam a hipótese de que as isoenzimas lipoxigenases são enzimas-chave no sistema de defesa de plantas de soja contra herbívoros e que o acúmulo de inibidores de proteases é, provavelmente, um mecanismo de defesa da planta. As análises dos níveis de hexanal e aldeídos totais nos dois experimentos revelaram aumento significativo nos níveis de aldeídos totais após a remoção dos insetos, para os dois genótipos, no tratamento com lagarta; e aumento mais significativo para mosca-branca antes da remoção, para a linhagem IAC- 100 TN. Uma produção significativa de hexanal só ocorreu para a variedade IAC-100, no tratamento com mosca-branca. Esses resultados sugerem que o mecanismo de defesa de plantas de soja submetidas ao ataque de insetos- praga, pela via das lipoxigenases, também pode seguir o caminho de produção de aldeídos.Item Caracterização da via das lipoxigenases de folhas de soja submetidas a ferimento(Universidade Federal de Viçosa, 1998-12-15) Vieira, Angélica Aparecida; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/2783807013089028No presente trabalho foi avaliada a capacidade da planta de soja de responder ao ferimento mecânico através da via das lipoxigenases. Para isso, foi analisado o efeito do ferimento mecânico em folhas de soja sobre a atividade do “pool” de lipoxigenases (LOXs) e os possíveis produtos finais da via. Foram utilizados dois genótipos: um normal (variedade IAC-100) e outro com ausência de LOXs em suas sementes (linhagem IAC-100 TN). Folhas de plantas de soja dos dois genótipos foram submetidas a ferimento mecânico e coletadas 0, 6, 12, 24, 48 e 168 horas após o ferimento. Foram analisadas a resposta local e a resposta sistêmica. Os resultados do estudo bioquímico e cinético das LOXs de folhas de soja dos genótipos revelaram dois picos mais acentuados de atividade de LOXs a pH 4,5 e 6,0, tanto na resposta local quanto na sistêmica. O valor da temperatura ótima das isoenzimas de LOXs a pH 6,0 foi a 25 oC; valores de KM aparente na resposta local e na sistêmica aumentaram consideravelmente seis horas após o ferimento e diminuíram a partir de 12 horas, tendo em 168 horas o menor valor. O menor valor de KMapp em 168 horas sugere uma alteração do “pool” de LOXs em resposta ao ferimento nos dois genótipos analisados. Estes resultados indicam que a remoção genética das LOXs de semente de soja não está interferindo na expressão dos genes que codificam para as LOXs que atuam no mecanismo de defesa da planta de soja contra danos causados por ferimento. Os resultados do estudo dos produtos da via das lipoxigenases revelaram que nos dois genótipos ocorreu aumento de inibição tríptica após ferimento na resposta local e na sistêmica. Os valores em mg de tripsina inibida de proteína foram maiores em 6, 12, 24, 48 e 168 horas. Os resultados deste trabalho reforçam a hipótese de que em folhas de soja ocorre aumento da produção de inibidores de proteases em resposta a ferimento. Em ambos os genótipos estudados ocorreu ligeiro aumento dos níveis de hexanal em 48 e 168 horas e de aldeídos totais em 168 horas após tratamento. Neste estudo, os resultados mostraram que ocorreu aumento da atividade de lipoxigenases e de inibidores de proteases nas plantas de soja submetidas a ferimento. A remoção genética de LOXs da semente de soja no genótipo IAC 100 TN não interferiu na defesa da planta, pela via das lipoxigenases, em resposta ao ferimento mecânico.Item Caracterização de uma proteína secretória de soja e de sua interação com BiP(Universidade Federal de Viçosa, 1998-07-20) Matrangolo, Fabiana da Silva Vieira; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/8394545512645315Proteínas solúveis e de membrana da rota secretora são inicialmente endereçadas ao retículo endoplasmático (RE) e translocadas através da membrana deste. Em seguida, elas transitam através do Golgi para alcançar os compartimentos subcelulares e o meio extracelular. O RE mantém uma eficiente maquinaria de translocação, dobramento, associação, montagem de oligômeros e controle de qualidade de proteínas secretórias. A proteína BiP ("Binding Protein"), residente no RE, exibe atividade de chaperone molecular e participa ativamente neste processo por meio de interações proteína:proteína. Com o objetivo de identificar substratos potenciais de BiP, anticorpos contra frações microssomais isoladas da semente de soja foram usados para o escrutínio de uma biblioteca de expressão. Um clone de cDNA, denominado pUFVS64, que codifica uma proteína secretória, foi isolado e caracterizado. A proteína, codificada por pUFVS64 e denominada S-64, é sintetizada na semente de soja, em baixos níveis, e possui uma identidade de seqüência de 85% com uma proteína de membrana que se liga à sacarose, denominada SBP ("Sucrose Binding Protein"). Células intactas foram utilizadas para introdução de genes via eletroporação, ou biobalística, com o objetivo de aumentar a síntese da proteína S-64 em suspensões celulares de soja, de forma a aumentar a sensibilidade dos ensaios para determinação de associações entre as proteínas BiP e S-64.A associação entre BiP e S-64 foi avaliada, levando-se em consideração características bioquímicas diferenciadas, associadas com as referidas proteínas. Ensaios de sedimentação por afinidade, com o uso das resinas de ATP-agarose, GTP-agarose e ConA- sepharose, foram conduzidos, utilizando-se extratos de proteína total, de suspensões celulares de soja. Tanto S-64 quanto BiP são co-precipitadas por GTP-agarose, embora BiP não se associe com este nucleotídeo. A capacidade da resina GTP-agarose em sedimentar BiP reflete associação prévia entre BiP e uma proteína que liga GTP. Similarmente, ATP-agarose foi eficiente em co-sedimentar ambas as proteínas, embora apenas BiP se ligue diretamente à ATP. A sedimentação indireta de S-64 pela resina ATP-agarose demonstrou que S-64 estava a uma proteína que liga a ATP. A proteína S-64 é glicosilada e se liga diretamente a ConA-sepharose, enquanto BiP não se associa diretamente com concanavalina-A. Mesmo assim, BiP foi co-sedimentada indiretamente por ConA- sepharose. Coletivamente, estes resultados sugerem que S-64 interage com BiP, constituindo um substrato em potencial para caracterização de associações mediadas pela proteína BiP de plantas.Item Caracterização biológica e purificação da proteína BiP da soja (Glycine max (L.) Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 1997-07-25) Carolino, Sônia Madali Boseja; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4252852403677230A proteína BiP, residente no lúmen do retículo endoplasmático (RE), tem sido descrita como um componente importante no processo de dobramento e montagem de proteínas secretórias recém-sintetizadas. Com base na localização subcelular, identidade imunológica, massa molecular relativa e síntese constitutiva, foi possível identificar o homólogo de BiP da soja, usando-se anticorpos preparados contra BiP do milho. A análise do padrão de acúmulo da proteína BiP revelou que a sua síntese é coordenada, temporalmente, com a síntese de proteínas de reserva na semente. Além disso, a síntese de BiP é correlacionada com a concentração de proteína total acumulada na semente de diferentes variedades de soja. Esses resultados indicam que a proteína BiP é induzida pelo aumento da atividade secretória do cotilédone, associada à síntese ativa de proteínas de reserva. Consistente com sua função de chaperone molecular, BiP é induzida em resposta a diversos estresses fisiológicos que promovem a proliferação do RE e o acúmulo de proteínas mal dobradas nesta organela. Infestação por Tetranichus urticae e infecção por Cercospora sojina Hara induziram a síntese de BiP em níveis comparáveis. Similarmente, sua síntese foi induzida, significativamente, em resposta a estresse nutricional. Ao contrário de BiP de espinafre, BiP de soja é regulada positivamente por estresse hídrico. Esses resultados contraditórios indicam que vias distintas de mecanismos regulatórios controlam a expressão dos genes BiP em plantas. Como membro da família Hsp70, foi demonstrado que a proteína BiP da soja se liga a ATP e associa-se com polipeptídios sintetizados exclusivamente na semente. No entanto, o complexo formado entre BiP e esses polipeptídios é altamente estável e insensível a ATP. A propriedade de BiP de se ligar a ATP foi explorada como meio de purificar essa proteína a partir de extratos protéicos de sementes, usando-se cromatografia de afinidade em resinas de ATP-agarose. Conforme julgado através de géis de acrilamida corados com prata, BiP foi purificada em um nível de homogeneidade em torno de 90%. A identidade da proteína purificada foi confirmada, uma vez que seus anticorpos reconheceram eficientemente a proteína expressa pelo clone cUFVBiP1, que codifica BiP da soja.Item Caracterização nutricional da plasteína obtida da proteína da folha de mandioca, da soja e do soro de queijo(Universidade Federal de Viçosa, 1996-09-26) Souza, Eliana Carla Gomes de; Nagem, Tanus Jorge; http://lattes.cnpq.br/1749833699813885Com o objetivo de testar o aproveitamento de fontes protéicas de baixo custo (folha de mandioca, do soro de queijo e da soja) através da reação da plasteína, para obtenção de um produto com propriedades físico-químicas e nutricionais satisfatórias para fins na alimentação humana, foram preparados o isolado protéico de folha de mandioca (IPFM), o concentrado protéico de soro ultrafiltrado (CPSU) pelo processo de ultrafiltração e adquirido no mercado o isolado protéico de soja. O IPFM e o CPSU foram desengordurados após a obtenção. O IPFM, CPSU e o isolado protéico de soja (Proteimax- 90 HG) foram submetidos separadamente ao processo de hidrólise enzimática. Em seguida, foram misturados e submetidos ao processo de ressíntese enzimática, utilizando-se pancreatina em diferentes valores de pH para hidrólise e síntese. Durante as reações foram controlados temperatura, tempo de reação, pH e concentração da enzima e do substrato. Foram dialisados a plasteína e o sobrenadante de plasteína. Os teores protéicos da plasteína precipitada e do sobrenadante de plasteína foram 52,6 e 72,0%, respectivamente, sendo o teor protéico do sobrenadante da plasteína superior ao do concentrado protéico de soro ultrafiltrado e do isolado protéico de folha de mandioca. Os resultados da atividade de urease demonstraram que houve destruição quase completa de todos estes fatores. Pode-se verificar que tanto as matérias - primas quanto os produtos obtidos podem ser considerados boas fontes de aminoácidos essenciais, principalmente para adultos e criança após o desmame. Os valores do Quociente da Eficiência Líquida Protéica (NPR) das plasteínas não diferiram estatisticamente dos apresentados pela caseína e o valor da Utilização Líquida da Proteína (NPU) da plasteína precipitada não diferiu estatisticamente da caseína e o do sobrenadante de plasteína foi inferior ao padrão de caseína. A plasteína precipitada e o sobrenadante de plasteína apresentaram valores de digestibilidade significativamente inferiores (P< 0,05) ao padrão, com adequação de 70,3 e 91,2%, respectivamente, em relação à caseína. A plasteína precipitada e o sobrenadante de plasteína são boas fontes de cobre e sódio e não são boas fontes de cálcio e potássio. A plasteína precipitada é boa fonte de ferro, manganês, magnésio e zinco, segundo recomendação do RDA (1989). Pode-se concluir que com a reação de plasteína, há uma melhoria na qualidade protéica de fontes alternativas.