Fisiologia Vegetal
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Item Análise funcional da via de sinalização antiviral mediada por NIK em tomateiro(Universidade Federal de Viçosa, 2010-02-18) Apfata, Jorge Alberto Condori; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/5501687466580841; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6; Santos, Anésia Aparecida dos; http://lattes.cnpq.br/8527394593088827A proteína NSP de begomovírus facilita o transporte do DNA viral do núcleo para o citoplasma e coopera com a proteína de movimento MP para promover o transporte do DNA viral às células adjacentes não infectadas através dos plasmodesmas. A proteína NSP interage com membros da família LRR-RLK ( leucine- rich repeat receptor like kinase ), designados NIK ( NSP-Interacting Kinase ). A ligação de NSP na alça de ativação de NIK inibe a atividade quinase, e conseqüentemente, a proteína viral inibe a atividade de autofosforilação desses receptores e sua atividade de defesa antiviral. Estudos de mutagênese na alça de ativação de NIK demonstraram que o resíduo Treonina 474 é fosforilado in vitro e exerce uma função crucial para atividade de quinase que é requerida para sinalização antiviral. Mutação no resíduo de Thr-474 para aspartato resulta no mutante T474D que exibe ativação constitutiva, atividade de fosforilaçao do substrato aumentada e menor efeito inibidor de NSP. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o domínio quinase de NIK na resposta de defesa antiviral em tomateiros. Tomateiros foram transformados com a construção que codifica para NIK super ativa (35S-AtNIK-T474D). Os transformantes primários foram selecionados por PCR e a expressão do transgene em linhagens independentes foi confirmada por RT-PCR normal e em tempo real. A super expressão da NIK1 e NIK- T474D super ativa em tomateiros promoveu um alongamento de entrenós, mas afetou negativamente o desenvolvimento do sistema radicular, demonstrando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK e vias de sinalização de desenvolvimento. Experimentos de infectividade foram conduzidos em linhagens transgênicas superexpressando AtNIK ou AtNIK-T474D, utilizando o vírus ToYSV-[MG-Bi2]. Super expressão de NIK super ativa alterou a taxa de infecção por ToYSV e interferiu no desenvolvimento dos sintomas. Comparado com as plantas não transformadas e a linhagem transgênica 35S-AtNIK1-6 superexpressando NIK normal, a taxa de infecção foi inferior e os sintomas mais atenuados em linhagens transgênicas independentes superexpressando AtNIK-T474D. Estes resultados confirmam in planta o papel essencial da fosforilação do resíduo de Treonina 474 de NIK e indicam a possibilidade de se desenvolverem estratégias de tolerância a geminivirus mais eficientes.Item Caracterização fisiológica de plantas superexpressando GmNAC6 em soja e seus efeitos na morte celular programada(Universidade Federal de Viçosa, 2013-04-04) Mendes, Giselle Camargo; Nesi, Adriano Nunes; http://lattes.cnpq.br/4220071266183271; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/4507854638255402; Araujo, Wagner Luiz; http://lattes.cnpq.br/8790852022120851; Martins, Gilberto Sachetto; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785612D0; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8O estresse no RE e o estresse osmótico prolongado convergem sinergicamente para a indução das proteínas N-Rich (NRP), as quais ativam o sinal de morte celular mediado pelas proteínas GmNAC6 em soja. Para identificar novos componentes da via de sinalização induzida por estresses que geram a resposta de morte celular programada (Programmed cell death - PCD) foi realizado um ensaio de duplo híbrido para identificar os parceiros de GmNAC6. Foi descoberto outro membro da família NAC, GmNAC30, capaz de interagir com GmNAC6 no núcleo de células de plantas para regular coordenadamente promotores dos genes alvos comuns, que possuem o cis elemento comum TGTG [TGC]. Nós descobrimos que GmNAC6 e GmNAC30 podem funcionar como ativadores ou repressores da transcrição e cooperam entre si para melhorar a regulação da transcrição de promotores alvo comuns, sugerindo que a heterodimerização pode ser necessária para a completa regulação da expressão do gene. Assim, GmNAC6 e GmNAC30 apresentam um perfil de expressão que se sobrepõe em resposta a vários estímulos ambientais e durante o desenvolvimento vegetal. Consistente com o papel na morte celular programada, GmNAC6 e GmNAC30 se ligam in vivo e transativam os promotores de enzimas hidrolíticas em protoplastos de soja. Um cis-elemento onde GmNAC6/GmNAC30 se ligam foi encontrado no promotor do gene que codifica uma enzima de processamento vacuolar (Vacuolar processing enzyme - VPE), a qual tem atividade de caspase-1 e é um executor da morte celular programada em plantas. Nós demonstramos que a expressão de GmNAC6 juntamente com GmNAC30 transativa o gene VPE em protoplastos de soja. Coletivamente, nossos resultados indicam que GmNAC30 coopera com GmNAC6 para induzir o evento de PCD pela ativação de VPE. A interpretação que GmNAC6 funciona como regulador da PCD induzida por estresse via indução de VPE, uma enzima chave envolvida na morte celular programada pelo colapso do vacúolo, levantou a possibilidade que GmNAC6 funcione como um regulador da senescência foliar. Para elucidar esta questão, plantas de soja variedade BR16 foram transformadas com o gene GmNAC6 sob o controle do promotor 35S, e a análise da incorporação do transgene foi realizada por PCR até a terceira geração. Três linhagens transgênicas homozigotas (geração T3) foram selecionadas e apresentaram níveis semelhantes de expressão de GmNAC6. As três linhagens transgênicas (GmNAC6.1, GmNAC6.2 e GmNAC6.3) foram fenotipicamente idênticas à linhagem controle (não transformada) durante a fase vegetativa de desenvolvimento e durante o florescimento. No entanto, na fase reprodutiva de desenvolvimento R3, a senescência foliar das linhagens transgênicas foi acelerada em comparação com as plantas controle. Em todas as três linhagens transgênicas, a expressão ectópica de GmNAC6 acelerou o amarelecimento foliar, o qual está associado a uma maior perda de pigmentos (clorofila-a e b, e os carotenóides) e ao maior acumúmulo de ROS em comparação com as plantas controle. Além disso, a senescência precoce das plantas transgênicas foi associada a uma maior indução de genes marcadores de senescência nas folhas na fase R3 de desenvolvimento em comparação com os níveis nas folhas das plantas controle. Consistente com o papel como um regulador da transcrição da expressão do gene VPE, a superexpressão de GmNAC6 induziu um acúmulo muito maior dos transcritos VPE nas linhas transgênicas quando comparado as plantas controle no mesmo estádio de desenvolvimento R3. Sabendo que VPE media a morte celular pelo colapso do vacúolo, que GmNAC6 induz a expressão de VPE e que o aceleramento da senescência nas plantas transgênicas esta associado a expressão temporal e espacial de VPE, é razoável propor que GmNAC6 regula a senescência foliar via indução da VPE, um tipo de PCD que é mediada pelo colapso vacuolar. Como mais uma evidência de que GmNAC6 pode regular a senescência foliar, as linhagens transgênicas super expressando GmNAC6 exibem uma maior sensibilidade ao estresse abiótico, ao estresse osmótico, ao estresse do RE e a seca. Portanto, os resultados da presente investigação suportam ainda mais a noção de que a tolerância das plantas ao estresse abiótico está geneticamente ligada à longevidade da folha.Item Caracterização funcional de uma PERK quinase de Arabidopsis thaliana que interage com a proteína NSP de Geminivírus(Universidade Federal de Viçosa, 2006-02-23) Florentino, Lílian Hasegawa; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4757604E9; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Almeida, Andréa Miyasaka de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4792501H4Geminivírus constitui um grande grupo de vírus de planta, cujo genoma é empacotado na forma de DNA circular fita simples em partículas icosaédricas geminadas e é convertido em uma forma fita dupla no núcleo de células diferenciadas de plantas. A maioria dos membros do gênero Begomovirus, como o Cabbage leaf curl vírus (CaLCuV), possuem dois componentes genômicos, DNA-A e DNA-B. O DNA-A apresenta o potencial para codificar cinco produtos gênicos (AV1, AC1, AC2, AC3, AC4) e está envolvido na replicação, ativação transcricional de genes virais e encapsidação do genoma viral. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein MP (BC1) e Nuclear Shuttle Protein NSP (BV1), ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e então atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. A localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula- a-célula do DNA viral predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no citoplasma quanto no núcleo. De fato, foi demonstrado que NSP interage com uma proteína receptora da membrana plasmática, designada NIK, e uma acetiltransferase nuclear. Através de ensaio de duplo híbrido, foi identificada, uma PERK quinase ( proline-rich extensin-like receptor protein kinase ) de Arabidopsis thaliana que interage especificamente com NSP de CaLCuV e, também de geminivírus que infectam tomate, a qual foi designada NsAK ( NSP-associated kinase ) e é estruturalmente organizada em um domínio N-terminal rico em prolina seguido de um segmento transmembrana e de um domínio C-terminal de serina/treonina quinase. A proteína viral interagiu estavelmente com versões defectivas do domínio de quinase de NsAK, mas não com a enzima potencialmente ativa em um ensaio de ligação in vitro. NsAK traduzida in vitro aumentou o nível de fosforilação de NSP, indicando que NSP atua como substrato de NsAK. Estes resultados demonstram que NsAK é uma autêntica serina/treonina quinase e sugerem elo funcional para a formação do complexo NSP-NsAK. Esta interpretação foi corroborada por ensaios de infectividade in vivo, demonstrando que a perda de função de NsAK reduz a eficiência da infecção por CaLCuV e atenua o desenvolvimento dos sintomas. Estes dados implicam NsAK como um contribuidor positivo para a infecção por geminivírus e sugerem que NsAK pode regular a função de NSP.Item Expressão ectópica do gene NIK em tomateiros: Efeitos no desenvolvimento e na infecção por geminivírus(Universidade Federal de Viçosa, 2007-09-28) Pires, Silvana Rodrigues; Almeida, Andréa Miyasaka de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4792501H4; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783743U5; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://lattes.cnpq.br/8324209529190312; Pereira, Maria Cristina Baracat; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8Geminivírus são vírus de plantas com partículas semi- icosaédricas geminadas e genoma de DNA circular de fita simples, podendo ser mono ou bissegmentados, sendo, no último caso, os dois componentes genômicos, denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A, encontram-se os genes que codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e encapsidação. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein, MP e Nuclear Shuttle Protein, NSP, ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. Os geminivírus são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para sua proliferação. A proteína NSP interage com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (NSP-Interacting Kinase) de tomate, soja e Arabidopsis. Foi demonstrado, em estudos anteriores, que a inativação do gene NIK aumenta a suscetibilidade dos mutantes à infecção viral. Visando elucidar o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção por geminivírus, este estudo propôs uma avaliação dos efeitos da superexpressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus. Assim sendo, o gene NIK de Arabidopsis thaliana foi utilizado para transformar tomateiro. Os transformantes primários foram confirmados por PCR, selecionados por RT- PCR, de acordo com a expressão do transgene, repicados in vitro e utilizados em experimentos de análise de desenvolvimento in vitro e em casa-de-vegetação. Análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão da proteína promoveu retardo de crescimento dos transformantes, os quais apresentaram baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas. O fenótipo observado nas linhagens transgênicas superexpressando NIK é muito similar àquele resultante da inibição da via de biossíntese ou sinalização de brassinosteróides. Os ensaios de infectividade em tomateiro com o vírus ToYSV-[MG-Bi2] revelaram que a superexpresão de NIK causou atenuação dos sintomas uma vez que os transformantes apresentaram menor severidade de sintomas em relação ás linhagens não transformadas. Estes resultados são consistentes com o papel protetor de NIK contra a infecção viral e sugere que a sinalização mediada por NIK comunica-se, em algum nível, com a via de sinalização de brassinosteróides.Item Identificação de regiões no promotor do gene SBP2 (sucrose binding protein) de soja que conferem expressão espacial específica(Universidade Federal de Viçosa, 2007-03-29) Freitas, Rejane do Livramento; Almeida, Andréa Miyasaka de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4792501H4; Loureiro, Marcelo Ehlers; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780851Y3; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4737720E9; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; Carvalho, Claudine Márcia; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4794965T6O promotor do gene SBP2 (sucrose binding protein) de soja é capaz de dirigir a expressão tecido vascular-específica de genes repórteres em plantas transgênicas de tabaco. Esta regulação se deve à presença de domínios cisregulatórios distais (CRD-A, posição -2000 a -700) presentes no promotor. Neste trabalho, a atividade tecido-específica de CRD-A foi confirmada por meio de experimentos de ganho-de-função, nos quais o fragmento CRD-A foi diretamente fusionado ao gene repórter GUS e às construções -136pSBP2-GUS e -92pSBP2-GUS e sua atividade avaliada no sistema heterólogo de tabaco. CRDA foi capaz de reduzir a atividade de GUS em todos os órgãos analisados, restaurando, em alguns casos, o padrão tecido-específico do promotor completo. Além disso, observou-se que CRD-A é capaz de promover a transcrição de GUS, independente de promotor mínimo, indicando a presença de cis-elementos capazes de promoverem a transcrição basal. De fato, nessa região (-2000 a -700) foram identificados vários elementos TATA box, localizados nas posições -790, -783 e -761, que podem potencialmente funcionar como TATA boxes alternativos. No intuito de delimitar os cis-elementos responsáveis pelo padrão tecido-específico do promotor SBP2, a seqüência -2000 a -700 foi dividida em cinco fragmentos, os quais foram inseridos na construção -92pSBP2-GUS, e utilizados para obtenção de plantas transgênicas. Análises histoquímicas revelaram que todos os fragmentos foram capazes de reduzir a atividade do promotor SBP2, uma vez que sua inserção na extremidade 5 de -92pSBP2 alterou o padrão de expressão constitutiva do mesmo. Com base nestes resultados, diversas regiões potencialmente regulatórias foram identificadas. A região compreendida entre -1765 e -945 deve conter fortes elementos repressores para o ápice caulinar, capazes de abolir totalmente a atividade do promotor, enquanto que a região entre -944 e -705 demonstrou conter elementos repressores mais fracos, que restringiram a expressão ao tecido vascular. Foram encontrados vários elementos silenciadores para a raiz, tanto para o meristema radicular (região entre -1765 e -705), quanto para a zona de alongamento (de -1765 a -1485 e de -1211 a -945). Além disso, a região de -1765 a -1485 também apresenta um forte repressor para raiz, cujo efeito deve ser atenuado por ciselementos presentes entre -1485 e -705. Por fim, foi identificado um elemento responsável por restringir a expressão apenas ao floema interno no caule, na região entre -1485 e -1212. A funcionalidade dos cis-elementos identificados foi avaliada através do ensaio de mudança na mobilidade eletroforética (EMSA), tendo sido observada a interação seqüência-específica entre possíveis transfatores presentes em extratos nucleares de soja e de tabaco e o fragmento -1765/-1485 (fragII) de GmSBP2. A fim de verificar se o acúmulo da proteína SBP2 correlaciona-se com a atividade do promotor em tecidos específicos, foi obtida a proteína quimérica SBP2-GFP, sob o controle do promotor SBP2, em tabacos transgênicos. A análise de fluorescência revelou que a proteína SBP2 está, de fato, localizada na região de tecido vascular, consistente com o padrão de atividade do gene repórter e com seu envolvimento nos processos fisiológicos dependentes de translocação de sacarose.