Expressão ectópica do gene NIK em tomateiros: Efeitos no desenvolvimento e na infecção por geminivírus

Abstract

Geminivírus são vírus de plantas com partículas semi- icosaédricas geminadas e genoma de DNA circular de fita simples, podendo ser mono ou bissegmentados, sendo, no último caso, os dois componentes genômicos, denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A, encontram-se os genes que codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e encapsidação. O DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein, MP e Nuclear Shuttle Protein, NSP, ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e atua cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular. Os geminivírus são altamente dependentes de fatores do hospedeiro para sua proliferação. A proteína NSP interage com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada NIK (NSP-Interacting Kinase) de tomate, soja e Arabidopsis. Foi demonstrado, em estudos anteriores, que a inativação do gene NIK aumenta a suscetibilidade dos mutantes à infecção viral. Visando elucidar o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção por geminivírus, este estudo propôs uma avaliação dos efeitos da superexpressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus. Assim sendo, o gene NIK de Arabidopsis thaliana foi utilizado para transformar tomateiro. Os transformantes primários foram confirmados por PCR, selecionados por RT- PCR, de acordo com a expressão do transgene, repicados in vitro e utilizados em experimentos de análise de desenvolvimento in vitro e em casa-de-vegetação. Análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão da proteína promoveu retardo de crescimento dos transformantes, os quais apresentaram baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas. O fenótipo observado nas linhagens transgênicas superexpressando NIK é muito similar àquele resultante da inibição da via de biossíntese ou sinalização de brassinosteróides. Os ensaios de infectividade em tomateiro com o vírus ToYSV-[MG-Bi2] revelaram que a superexpresão de NIK causou atenuação dos sintomas uma vez que os transformantes apresentaram menor severidade de sintomas em relação ás linhagens não transformadas. Estes resultados são consistentes com o papel protetor de NIK contra a infecção viral e sugere que a sinalização mediada por NIK comunica-se, em algum nível, com a via de sinalização de brassinosteróides.Geminivirus are plant virus packed as geminate semi- icosahedral particles and single-stranded circular DNA genomes. They can be either mono or bipartite and in the bipartite geminivirus, the genomic components are designated DNA-A and DNA-B. DNA-A encodes the proteins needed for replication, transactivation and encapsidation of the viral genome. DNA-B encodes two movement proteins, Movement Protein, MP, and Nuclear Shuttle Protein, NSP, both required for the establishment of a systemic infection. NSP transports the viral DNA between the nucleus and cytoplasm and acts cooperatively with MP to move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The geminivirus are highly dependent on the host factors for proliferation and spread. NSP interacts with a plasma membrane receptor kinase, designated NIK (NSP- interacting kinase), from tomato, soybean and Arabidopsis. It has been demonstrated previously that inactivation of NIK gene enhances the susceptibility of the mutant to geminivirus infection. To elucidate the possible role of NIK in the protection mechanism to geminivirus infection, we investigated here the effects of NIK overexpression in the tomato response to geminivirus infection. The NIK gene from Arabidopsis thaliana was used to transform tomato. The primary transformants were confirmed by PCR, selected by RT-PCR according to the transgene expression, in vitro replicated and used for developmental analysis in vitro and in green house. NIK overexpression affected the overall developmental performance of transgenic lines which display delayed and stunted growth, with lower stem, less developed root and shoot systems and a leaf curly phenotype. These transgenic line phenotypes overexpression NIK were similar to that displayed by inhibition of Brassinosteroid synthesis or signaling. Infectivity assays in tomato with ToYSV-[MG-Bi2] revealed that overexpression of NIK caused attenuation of symptom, as the transgenic lines developed less severe symptoms in comparison with the untransformed lines. These results are consistent with a protective role of NIK against viral infection and suggest that the NIK-mediated signaling communicates to some level with the brassinosteroid signaling.