Cloning and functional characterization of the OBSCURAVENOSA gene in tomato (Solanum lycopersicum L.)

Abstract

Heterobaric and homobaric leaves are found in many plant families and have a remarkable distribution in nature. What differentiates these two types of leaves is the presence or absence of bundle sheath extensions (BSEs), a structural trait which produces different physiological responses. Leaves with BSEs (heterobaric) have greater hydraulic integration and greater photosynthetic performance, on the other hand, leaves without BSEs (homobaric) have uniform photosynthesis along the blade and probably an improved mechanism to control water loss under stress conditions. Tomatoes currently cultivated were selected after long years of crop breeding. Originally, tomato is a heterobaric crop, however, most field cultivars have a spontaneous recessive mutation known as obscuravenosa (obv) and, as a consequence, have lost the BSEs. For several years, this mutation was unconsciously selected in conjunction with other traits of agronomic interest. This suggests that the variation between homobaric and heterobaric characters has agronomic value in tomato. The first step to better understand the impacts of BSE at the plant level and to be able to manipulate it within the tomato crop and in other crops is knowing the genes involved in its formation. For this, we use tomato as a model to elucidate the molecular bases that control the development of BSEs. Using publicly available resources combined with in silico analysis, we identified a strong candidate gene for the obv mutation. Solyc05g054030 has a SNP (A→G) in the third exon, which leads to the exchange of a histidine residue for arginine at position 135 of the protein. The gene encodes a zinc finger transcription factor C2H2 type. We have shown through predictions that the OBV protein has three classic zinc finger domains, which allow interaction with DNA. In the obv mutant, the exchange of histidine for arginine caused the loss of a zinc finger motif, which may have led to the interruption of the protein functionality. We complemented the obv mutant with the functional OBV allele recovering the clear vein phenotype . OBV further regulates the leaf insertion angle, leaf serration, vein density and fruit shape. OBV appears to coordinate the development of BSEs through an auxin-mediated mechanism, specifically by changes in some members involved in auxin signaling (ARFs and Aux/IAAs). We have identified a link between OBV and AUXIN RESPONSE FACTOR 4 (ARF4). The findings reported here will give support for identification of other components linked to the molecular pathway that directs the formation of BSEs in leaves. Keywords: Bundle Sheath Extension. Heterobaric leaf. Molecular cloning. Auxin.

Folhas heterobáricas e homobáricas são encontradas em muitas famílias de plantas e têm uma interessante distribuição na natureza. O que diferencia esses dois tipos de folhas é a presença ou ausência de extensões de bainha do feixe (BSEs), essa diferença estrutural confere respostas fisiológicas distintas. Folhas com BSEs (heterobáricas) apresentam maior integração hidráulica e maior desempenho fotossintético, por outro lado, folhas sem BSEs (homobáricas) possuem fotossíntese uniforme ao longo da lâmina e provavelmente um mecanismo aprimorado para controlar a perda de água em condições de estresse. Os tomates cultivados atualmente foram selecionados após longos anos de melhoramento genético. Originalmente o tomate é uma cultura heterobárica, porém, a maioria das cultivares de campo possuem uma mutação recessiva espontânea conhecida como obscuravenosa (obv) e, como consequência, perderam a BSE. Por vários anos essa mutação foi selecionada inconscientemente em conjunto com outras características de interesse agronômico. Isso sugere que a variação entre os caracteres homobárico e heterobárico tem valor agronômico em tomateiro. O primeiro passo para entender melhor os impactos da BSE a nível de planta e poder manipula-la dentro da cultura do tomateiro e em outras culturas é conhecendo os genes envolvidos na sua formação. Para isso, utilizamos o tomate como cultura modelo para elucidar as bases moleculares que controlam o desenvolvimento de BSEs. Utilizando recursos disponíveis publicamente combinados com análises in silico, identificamos um forte gene candidato para a mutação obv. O locus solyc05g054030 possui um SNP (A→G) no terceiro exon, que leva à troca de um resíduo histidina por arginina na posição 135 da proteína. O gene codifica um fator de transcrição zinc finger do tipo C2H2. Mostramos por meio de predições que a proteína OBV tem três domínios zinc finger clássicos, que permitem a interação no DNA. No mutante obv, a troca da histidina por arginina ocasionou a perda de um motivo zinc finger, o que pode ter levado à interrupção na funcionalidade da proteína. Complementamos o mutante obv com o alelo OBV funcional, recuperando o fenótipo de veia clara. Além de ser um controlador chave na formação das BSEs, OBV regula o ângulo de inserção da folha, serrilhamento foliar, densidade de veias e formato do fruto. OBV coordena o desenvolvimento de BSEs por meio de um mecanismo mediado por auxina, especificamente por mudanças em alguns membros envolvidos na sinalização de auxina (ARFs e Aux/IAAs). Identificamos uma ligação entre OBV e AUXIN RESPONSE FACTOR 4 (ARF4). As descobertas aqui relatadas servirão de suporte para a identificação de outros componentes ligados à via molecular que direciona a formação de BSEs nas folhas. Palavras-chave: Extensão da Bainha do Feixe. Folha heterobárica. Clonagem molecular. Auxina.