Photoperiod, salinity, and elicitors modulate the growth, morphophysiology, and biosynthesis of 20-hydroxyecdysone in Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen

Abstract

Pfaffia glomerata is a plant widely used in traditional medicine, and a major producer of the secondary metabolite 20-hydroxyecdysone (20-E). Studies indicate that the biosynthesis of 20- E in P. glomerata can be regulated by abiotic stresses, but the mechanisms involved in this regulation are still unclear. Aiming to understand the physiological and molecular basis involved in the regulation of 20-E biosynthesis in P. glomerata, as affected by abiotic factors, ploidy level, and elicitation, three experiments were conducted. In the first experiment, plants of P. glomerata (accessions 22 and 43) were grown in vitro for 40 days under 4 different daily photoperiods: 4, 8, 16, and 24 h of light. We found that plants exhibited higher photosynthesis and biomass accumulation when grown in longer photoperiods. The plants also had anatomical and primary metabolism changes in response to the photoperiods tested, and the magnitude of these changes was accession-dependent. Furthermore, longer photoperiods promoted an increase in 20-E production, possibly as a result of higher carbon availability in the plants. In the second experiment, P. glomerata plants were grown in vitro and subjected to the following treatments: NaCl (50 mM), 5-azacytidine (5-azaC, 25 μM), and NaCl+5-azaC. After 40 days, we observed that the treatments promoted a significant reduction in growth and photosynthesis, as well as an increase in reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzyme production and an adjustment in primary metabolism. Through proteomic analyses, we identified differentially accumulated proteins mainly associated with the metabolism of carbohydrates, amino acids, and secondary metabolites, which may help us understand the salt stress and 5-azaC tolerance responses compared to control. Besides, we found that the 5-azaC and NaCl+5-azaC treatments reduced the accumulation of jasmonate biosynthesis-related protein, and this may contribute to reduced 20-E signaling and biosynthesis. In the third experiment, two different ploidies of P. glomerata (A22, diploid; and P28, a tetraploid derived from A22) were grown in vitro for 40 days, and the plants were elicited in the first 20 days with methyl jasmonate (methyl-JA) and methyl salicylate (methyl-SA). The elicitors induced contrasting anatomical modifications in P. glomerata leaves. Elicitation also reduced the photosynthetic rate of the plants, with a consequent change in primary metabolite content and reduction in growth. Treatments with methyl-JA and methyl-SA promoted oxidative stress, but also ROS mitigation by increasingantioxidant enzymes, and these changes were more significant in diploid plants. The production of 20-E was stimulated by elicitation with methyl-JA and was also higher in tetraploid plants. On the other hand, methyl-SA down-regulates Phantom gene expression, with a consequent reduction in 20-E biosynthesis. Taken together, our data provide important information on molecular, biochemical, and physiological mechanisms involved with the regulation of 20-E biosynthesis, as well as enable biotechnological strategies for increasing the production of this metabolite in P. glomerata plants grown in vitro. Keywords: Phytoecdysteroids. Abiotic stress. Photosynthesis. Medicinal plant. Proteomics. Phytohormones. Polyploidy.

Pfaffia glomerata é uma espécie amplamente utilizada na medicina tradicional, e uma das principais plantas produtoras do metabólito secundário 20-hidroxiecdisona (20-E). Estudos apontam que a biossíntese de 20-E em P. glomerata é regulada por estresses abióticos, mas os mecanismos envolvidos nessa regulação são pouco entendidos. Com o objetivo de compreender as bases fisiológicas e moleculares envolvidas na regulação da biossíntese da 20-E em P. glomerata, afetadas por fatores abióticos, pelo nível de ploidia e por elicitação, três experimentos foram conduzidos. No primeiro experimento, P. glomerata (acesso 22 e acesso 43) foram cultivadas in vitro por 40 dias em 4 diferentes fotoperíodos diários: 4, 8, 16 e 24 h de luz. As maiores taxas fotossintéticas e acúmulo de biomassa foram observadas em plantas cultivadas em fotoperíodos mais longos. As plantas também exibiram alterações anatômicas e no metabolismo primário em resposta aos fotoperíodos testados, sendo que a magnitude dessas variações foi acesso-dependente. Além disso, observamos que fotoperíodos mais longos levaram ao aumento na produção de 20-E, possivelmente como resultado da maior disponibilidade de carbono nas plantas. No segundo experimento, plantas de P. glomerata foram cultivadas in vitro submetidas aos seguintes tratamentos: NaCl (50 mM), 5-azacitidina (5-azaC, 25 μM), e NaCl+5-azaC. Após 40 dias, observou-se que os tratamentos promoveram redução significativa no crescimento e na fotossíntese, bem como incremento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de enzimas antioxidantes e um ajustamento no metabolismo primário. Através de análises proteômicas, identificou-se proteínas diferencialmente acumuladas principalmente associadas ao metabolismo de carboidratos, aminoácidos e metabólitos secundários, que podem nos ajudar a entender as respostas de tolerância ao estresse salino e a 5-azaC, quando comparadas ao controle. Além disso, os tratamentos 5-azaC e NaCl+5-azaC reduziram o acúmulo de proteína relacionada à biossíntese de jasmonato, o que pode contribuir para uma menor sinalização e biossíntese de 20-E. No terceiro experimento, duas diferentes ploidias de P. glomerata (A22, diploide; e P28, um tetraploide derivado de A22) foram cultivadas in vitro por 40 dias, sendo que nos 20 primeiros dias foram elicitadas com metil jasmonato (methyl-JA) e metil salicilato (methyl-SA). Os elicitores induziram modificações anatômicas contrastantes em folhas de P. glomerata. Aelicitação também reduziu a taxa fotossintética das plantas, com consequente alteração no conteúdo de metabólitos primários e redução no crescimento. Tratamentos com methyl-JA e methyl-SA promoveram não somente estresse oxidativo, mas também a mitigação de ROS por meio do incremento de enzimas antioxidantes, sendo que essas alterações foram mais significativas em plantas diploides. A produção de 20-E foi estimulada pela elicitação com metil-JA, bem como foi maior em plantas tetraploides. Por outro lado, metil-SA regula negativamente a expressão do gene Phantom, com consequente redução da biossíntese de 20- E. De modo geral, nossos dados fornecem informações importantes sobre mecanismos moleculares, bioquímicos e fisiológicos envolvidos com a regulação da biossíntese de 20-E, bem como provê estratégias biotecnológicas para o incremento da produção deste metabólito em plantas de P. glomerata cultivadas in vitro. Palavras-chave: Fitoecdisteróides. Estresse abiótico. Fotossíntese. Planta medicinal. Proteômica. Hormônios vegetais. Poliploidia.