Caracterização morfoanatômica, transcriptômica e estudo da aquisição de competência para a organogênese in vitro de espécies do gênero Melocactus (Cactaceae)

Abstract

O Brasil é área prioritária na conservação da família Cactaceae por possuir grande número de espécies endêmicas. No entanto, fatores como degradação do habitat e coleta ilegal para comercialização como ornamental tem levado algumas espécies dessa família ao perigo de extinção, dentre estas espécies estão Melocactus paucispinus e M. glaucescens. Neste contexto, as técnicas de cultura de tecidos são uma importante ferramenta, pois permitem a propagação in vitro de material vegetal em larga escala, fornecendo uma alternativa à retirada dos indivíduos do seu habitat para a comercialização como ornamental. Contudo, a propagação in vitro de Melocactus apresenta alguns desafios, como o baixo número de brotos por explante, de brotos com variação morfológica e a ocorrência de variação somaclonal. Apesar do crescente interesse dos Melocactus como ornamental e da sua forma de propagação in vitro ser via cladódio, pouco se sabe sobre os aspectos morfofisiológicos relacionados à aquisição de competência para a organogênese in vitro dos membros deste gênero. Com o objetivo de aumentar o conhecimento sobre os processos da organogênese em espécies do gênero Melocactus, foi realizada a caracterização anatômica do cladódio de M. glaucescens e M. paucispinus, assim como a análise da ploidia das regiões do cladódio e a microtomografia de raio-X. As duas espécies de Melocactus estudadas apresentaram o mesmo padrão de organização dos tecidos e picos de ploidia, onde a periferia do cladódio e a medula apresentaram quatro picos de ploidia (2C, 4C, 8C e ~16C), as raízes são diploides e o córtex do cladódio apresentou um pico a mais de ploidia (~32C). A mixoploidia do cladódio foi atribuída ao programa de formação dos diferentes tecidos que compõem este órgão, o qual possui como uma das principais funções o armazenamento de água. As células com alta ploidia passaram por endociclos que aumentaram seus conteúdos de DNA, o que permite que o volume de armazenamento de água nos vacúolos seja maior para que assim possam desempenhar sua função de parênquima aquífero. A análise de microtomografia de raio-X mostrou que o diâmetro das células da região do córtex é maior do que na periferia e na medula do cladódio, corroborando com os dados de ploidia. Para compreender as modificações anatômicas durante a organogênese de M. glaucescens, foi realizada a caracterização anatômica de explantes cultivados na ausência de regulador de crescimento e explantes cultivados na presença de 1,34 μM de ácido naftaleno acético (ANA), 17,76 μM de 6- benzilaminopurina (BA) e com as aréolas feridas. Além disso, foi realizada a análise de expressão do gene SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (MgSERK-like) nos mesmos tratamentos. Foi observada a formação de brotações derivadas da ativação da região meristemática das aréolas, assim como de regiões mais internas do cladódio, sendo que mais meristemoides foram observados no córtex dos explantes que foram submetidos à ação de reguladores de crescimento e ferimento. Este tratamento também mostrou elevado número de brotações, ocorrência de variação morfológica e expressão do gene MgSERK-like em todos os períodos analisados da organogênese. Alterações no padrão de expressão durante a organogênese in vitro também foram observadas nas análises de expressão diferencial (ED) de explantes antes e após a indução de organogênese na presença de 1,34 μM de ANA, 17,76 μM de BA e com as aréolas feridas. A análise do transcriptoma mostrou que os explantes antes da indução da organogênese apresentavam o metabolismo mais comprometido com o metabolismo primário, principalmente com a fotossíntese, além da alta expressão do fator de transcrição TCP, o qual é responsável pela forte dominância apical nessa espécie que não apresenta ramificações laterais naturalmente. As análises no Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, BiNGO e Plant Transcription Factor Database demonstram que o metabolismo nos explantes submetidos à organogênese é modificado e concentrado em genes relacionados com mitocôndria, parede celular, retículo endoplasmático, organização celular e biogênese, o que tem relação com o aumento da síntese de proteínas para dar suporte na divisão celular e formação de parede durante a regeneração. As análises de ED também indicam que os tecidos submetidos à organogênese apresentaram grande potencial na produção de compostos do metabolismo secundário, o que amplia as possibilidades de aplicação das culturas in vitro de M. glaucescens.Brazil is a priority area in the conservation of the Cactaceae family due its large number of endemic species. However, factors such as habitat degradation and illegal collection for commercialization as ornamental have taken some species of this family to the danger of extinction, among which are Melocactus paucispinus and M. glaucescens. In this context, tissue culture techniques are an important tool as they allow in vitro propagation of plant material on a large scale, providing an alternative to overharvesting for marketing as ornamental. However, the in vitro propagation of Melocactus presents some challenges, such as the low number of shoots per explant, shoots with morphological variation and the occurrence of somaclonal variation. Although the growing interest of Melocactus as ornamental and its in vitro propagation be via cladode, the knowledge about the morphophysiological aspects related to the acquisition of competence for the in vitro organogenesis in this species is limited so far. In order to increase the knowledge about organogenesis processes of Melocactus species, the anatomical characterization of M. glaucescens and M. paucispinus cladodium, as well as the ploidy of the cladode regions and X-ray micro-computed tomography (XRμCT) were performed. Both Melocactus species have the same pattern of tissue organization and ploidy peaks, where the cladode periphery and the pith presented four ploidy peaks (2C, 4C, 8C and ~16C), the roots are diploid and the cortex of the cladode showed an additional peak of ploidy (~32C). The mixoploidy of cladode was attributed to the formation program of the different tissues that compose this organ, which has as one of the main functions the water storage. The cells with higher ploidy passed through the endocycle, which increased their DNA contents, allowing the volume for water storage in the vacuoles to be larger so that they can perform their function as aquifer parenchyma. XRμCT analysis showed the cell lumen of the cortex region was larger than the periphery and pith of the cladode. In order to understand the anatomical changes during the organogenesis of M. glaucescens, anatomical characterization of explants cultivated in medium without plant growth regulator (PGR) and explants cultivated in the presence of 1.34 μM naphthalene acetic acid (ANA), 17.76 μM 6- benzylaminopurine (BA) and wounded areolas. In addition, expression analysis of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (MgSERK-like) gene was performed in the same treatments. The formation of shoots derived from the activation of the areolas meristematic region, as well as innermost regions of cladode, was observed, and more meristemoids were observed in the cortex of the explants that were submitted to PGR and wounding. This treatment also showed a higher number of shoots, morphological variation and expression of the MgSERK-like gene in all periods when the organogenesis was analyzed. Changes in the expression pattern during in vitro organogenesis were also observed in the analyses of differential expression (DE) of explants before and after the organogenesis induction in the presence of NAA 1.34 μM, BA 17.76 μM and wounded areolas. The differential transcriptome analysis showed that the metabolism of the explants before the organogenesis induction was compromised with the primary metabolism, mainly with the photosynthesis, besides the high expression of the transcription factor TCP, which is responsible for the strong apical dominance in this species, which does not have lateral branches naturally. Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, BiNGO, and Plant Transcription Factor Database analyses demonstrate that metabolism in explants submitted to organogenesis is modified and concentrated in genes related to mitochondria, cell wall, endoplasmic reticulum, cell organization and biogenesis, which is related to the increase of protein synthesis to support cell division and formation of cell wall during regeneration. DE analyzes also indicate that tissues submitted to organogenesis present great potential in the production of secondary metabolism compounds, which increases the possibilities of application of M. glaucescens in vitro cultures.