Ciências Agrárias
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Item Abordagens fenotípicas e moleculares aplicadas à seleção de cafeeiros arábica com resistência múltipla a estresses bióticos(Universidade Federal de Viçosa, 2022-02-25) Feitosa, Francielle de Matos; Caixeta, Eveline Teixeira; http://lattes.cnpq.br/2455145805181209O café é a segunda principal commodity no mercado mundial. A espécie Coffea arabica é uma das principais espécies cultivadas no mundo. No entanto, a cultura hospeda uma grande variedade de patógenos e pragas. Os patógenos Hemileia vastatrix e Colletotrichum kahawae são as doenças mais importantes da cultura, e a praga bicho-mineiro, impacta severamente a produtividade e qualidade de bebida. Assim, como forma de controle, o desenvolvimento de cultivares resistentes, com a utilização de marcadores moleculares auxiliam no progresso de melhoramento genético da cultura. O objetivo do trabalho foi identificar cafeeiros portadores de genes de resistência para as principais doenças do café; determinar a diversidade genética por meio de características morfológicas e estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP). O estudo foi composto por duas populações, a primeira, os cafeeiros em geração F 2 são provenientes do cruzamento entre cultivar resistente a ferrugem e CBD e outra ao bicho-mineiro, enquanto que a segunda, são originados de cruzamentos de cafeeiros arábicas com fontes de resistência (seleção indiana). A identificação de cafeeiros resistentes foi feita fenotipicamente e/ou molecularmente. A análise de diversidade genética foi baseada na distância generalizada de Mahalanobis e a seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP. Ambas populações apresentaram resistência múltipla para as principais doenças com diferentes combinações. Com base nas análises utilizando o método REML/BLUP, foi possível selecionar cafeeiros promissores por serem geneticamente divergentes e complementares pela análise de agrupamento e por proporcionar ganhos com a seleção principalmente para a característica infestação de bicho- mineiro. Além disso, foi possível observar que os materiais em desenvolvimento apresentam superioridade em relação as cultivares comerciais. Palavras-chave: Hemileia vastatrix. Colletotrichum kahawae. Melhoramento preventivo. Piramidação de genes.Item Identificação de análogos a genes de resistência (RGAs) a Hemileia vastatrix no genoma Coffea arabica e avaliação da expressão gênica na interação(Universidade Federal de Viçosa, 2022-05-25) Estanislau, Giovana Gomes; Caixeta, Eveline Teixeira; http://lattes.cnpq.br/7717591959904355Das mais de 100 espécies de café, Coffea arabica e Coffea canephora são as de maior interesse comercial. As pragas e doenças que incidem sobre os cafeeiros são responsáveis pela redução da qualidade e produtividade da cultura, além de elevarem os custos de produção e os riscos ambientais advindos da aplicação de agrotóxicos. Um exemplo é a doença causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Alternativas de controle das doenças do cafeeiro têm sido desenvolvidas, com destaque à obtenção e uso de cultivares resistentes. Sendo assim, os estudos do genoma e genética funcional de plantas e interações com patógenos aumentaram consideravelmente a compreensão acerca das bases moleculares associadas com o processo de infecção e defesa das plantas. Essas tecnologias têm fornecido oportunidade para selecionar novos alvos a serem incorporados nas novas cultivares com o objetivo de obter resistência duradoura. Um alvo candidato importante a ser explorado são os genes PRRs (Pattern Recognition Receptor) e R (Plant resistance genes), chamados de análogos de genes de resistência (Resistance Gene Analog -RGAs) que compartilham domínios e motivos conservados. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi identificar e classificar análogos a genes de resistência (RGAs) no genoma de C. arabica e analisar sua expressão em transcriptoma da interação Coffea-Hemileia vastatrix. Para isso, uma abordagem baseada em predição de domínios funcionais em proteínas codificadas pelos RGAs foi empregada, fazendo uso de duas ferramentas, sendo elas, o RRGPredictor e o DRAGO2.Foram identificadas dezenove classes gênicas e vinte e cinco genes candidatos com potencial envolvidos na resistência de C. arabica a H.vastatrix. No transcriptoma da interação Coffea-H. vastatrix foi observada uma possível atuação dos genes identificados na resistência pré-haustorial do cafeeiro. A identificação desses genes permitirá entender melhor como funciona a interação entre Coffea e Hemileia vastatrix, além de contribuírem para a seleção assistida de cultivares cafeeiras resistentes nos programas de melhoramento. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem no cafeeiro. Análogos de genes a resistência.Item Variabilidade patotípica de Hemileia vastatrix e resistência do cafeeiro a ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2018-12-10) Deras Perla, Manuel de Jesus; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk. & Br., é a principal doença em todos os países produtores de café no mundo. No Brasil, a doença causa perdas entre 35% e 50% e, na América Central e Colômbia, entre 20% e 80%. O Brasil possui o maior banco de germoplasma com acessos derivados do Híbrido de Timor (HDT), na Universidade Federal de Viçosa (UFV), o qual vem sendo utilizado e, ao longo dos anos, tem sido valioso para os programas de melhoramento, visando encontrar cultivares com resistência durável à ferrugem. Cultivares com resistência à ferrugem geradas por diferentes institutos de melhoramento genético de café no Brasil foram avaliadas em campo para conhecer seu comportamento em diferentes ambientes. As epidemias registradas na América Central de 2011 a 2013 foram decorrentes de diferentes fatores econômicos, ambientais e, possivelmente, do surgimento de novas raças de H. vastatrix; a suplantação da resistência de cultivares de café lançadas como resistentes à ferrugem no mundo todo também constitui um problema para os programas de melhoramento genético. Diante desses fatos, este estudo teve como objetivos: (i) avaliar fenotipicamente os acessos de HDT; (ii) estudar o comportamento de cultivares lançadas como resistentes pelos diferentes programas de melhoramento genético do Brasil; (III) avaliar a resistência de 12 cultivares às raças II (v5) e XXXIII (v5, 7, 9) de H. vastatrix; (IV) avaliar o teor de clorofila das cultivares resistentes à ferrugem; e (V) caracterizar as raças de H. vastatrix Berk. & Br. presentes em Honduras. A avaliação dos HDTs foi realizada no viveiro de café do Departamento de Fitopatologia da UFV. Para avaliação das cultivares com resistência à ferrugem, foram conduzidos experimentos em campo, em Varginha e Viçosa, no Estado de Minas Gerais. A caracterização de raças de H. vastatrix foi desenvolvida no Instituto Hondurenho do Café (IHCAFE), em Honduras. Vinte e oito cultivares lançadas como resistentes foram estudadas durante oito anos. Os testes visando avaliar a resistência de 12 cultivares às duas raças de H. vastatrix foram conduzidos em câmaras de incubação. O teor de clorofila a, b, total e carotenoides foi determinado nas 28 cultivares. Para caracterização de raças de H. vastatrix, isolados do patógeno foram coletados em lavouras de café em Honduras, nas cultivares Lempira e Catuaí vermelho, em diversas altitudes. A caracterização fisiológica de raças do patógeno foi baseada na ausência (resistente) ou presença (suscetível) de uredósporos nos discos foliares dos clones diferenciadores. Os resultados da avaliação dos acessos de HDT, utilizando a rede de correlações, mostrou que houve correlações significativas diferentes de zero nas características vigor, produção, diâmetro de copa e altura das plantas. Nos testes de cultivares resistentes à ferrugem, verificou-se predominância da resistência quantitativa, além de algumas cultivares terem apresentado tolerância à ferrugem. Cerca de 38,4% das cultivares avaliadas foram resistentes à raça II (v5) e 100% suscetíveis à raça XXXIII (v5, 7, 9) de H. vastatrix. Quanto aos teores de clorofilas e carotenoides, houve grande variação dos valores entre os genótipos, porém não foi observada correlação com a produtividade e a incidência da ferrugem. Diante da rápida suplantação da resistência qualitativa das cultivares de café lançadas, recomenda-se buscar nos genótipos de café características de tolerância à doença, pelo fato de ser duradoura. Em se tratando da caracterização de raças de H. vastatrix, não foi possível enquadrar nenhuma das combinações dos genes de virulências dos isolados em raças patogênicas. Comprovou-se, portanto, a suplantação da resistência da variedade Lempira pelo fungo e foi feita a identificação de 16 patótipos do patógeno.Item Caracterização de sequências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-16) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Sakiyama, Ney Sussumu; http://lattes.cnpq.br/6208150945096223Para isso foram usadas três estrategias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estrategia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas sequências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as sequências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estrategias, identificou 14.060 sequências do PBGC. Essas sequências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas sequências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das sequências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucleicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas sequências com a resistência do cafeeiro a ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das sequências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSe/ect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemi/eia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.Item Identificação e análise funcional de efetores de Hemileia vastatrix, agente causal da ferrugem do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-27) Maia, Thiago Andrade; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; http://lattes.cnpq.br/6798704880640812; Resende, Mário Lúcio Vilela de; http://lattes.cnpq.br/8921922898103482; Barreto, Robert Weingart; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783300H6; Cunha, Luis Claudio Vieira da; http://lattes.cnpq.br/9367947173322278; Pacheco, Jorge Luis Badel; http://lattes.cnpq.br/4921932550244295A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é o principal problema fitossanitário da cafeicultura, podendo ocasionar perdas da ordem de 35 a 50% da produção se não forem implantadas medidas de controle. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugens secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Já foram identificados geneticamente pelo menos nove genes dominantes (SH1 a SH9) que conferem resistência à ferrugem do cafeeiro, no entanto, apesar de muitos anos de pesquisa neste patossistema, os genes Avr complementares de H. vastatrix ainda não foram identificados ou caracterizados. Uma abordagem que pode ser realizada com esta finalidade é a análise do transcriptôma e de bioinformática para identificar genes candidatos de H. vastatrix que cumpram uma lista de critérios específicos em banco de dados de sequências, seguida da validação por meio de ensaios funcionais para atividades de efetores. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: (i) identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas, expressas durante a germinação dos urediniósporos e também durante a fase biotrófica da interação com o cafeeiro; (ii) expressar genes candidatos a efetores de H. vastatrix, utilizando o sistema armadilha de secreção em levedura YST (Yeast Secretion Trap) para confirmação biológica da predição de secreção realizada por ferramentas de bioinformática; (iii) analisar a estrutura genômica dos genes candidatos a efetores selecionados; (iv) efetuar a análise da expressão temporal dos genes identificados durante as diferentes fases da patogênese; (v) estabelecer um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, com base no Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae. Inicialmente, caracterizou-se o secretoma de urediniósporos germinados de H. vastatrix por meio da construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA isolado de urediniósporos germinados in vitro por 16 horas. Após análises das sequências por ferramentas de bioinformática, foram selecionadas 146 ORFs que codificam proteínas secretadas. Durante a anotação dessas sequências constatou-se que 20% do secretoma de urediniósporos germinados são constituídos por enzimas hidrolíticas e que a maioria (67%) das proteínas secretadas identificadas possui função desconhecida. A partir dessas sequências foram selecionadas 35 ORFs completas que codificam proteínas com características comuns aos efetores de fungos filamentosos, denominados genes candidatos a efetores de H. vastatrix (HvECs H. vastatrix effector candidates). Desses, 22 HvECs tiveram suas sequências genômicas caracterizadas, confirmando as ORFs preditas por bioinformática. A secreção de oito HvECs selecionados foi comprovada em levedura, e sua expressão diferenciada, que possivelmente ocorre com as mudanças morfológicas do desenvolvimento do patógeno nos estágios inicias de infecção, foi comprovada por meio RT-qPCR. Posteriormente, caracterizou-se o secretoma de H. vastatrix expresso durante uma interação compatível com o cafeeiro, por meio da combinação de sequenciamento Sanger e pirossequenciamento 454. Esta abordagem integrada permitiu o sequenciamento massivo de um substancial número de etiquetas de sequências expressas (ESTs) em folhas de café infectadas com H. vastatrix, amostradas em quatro tempos diferentes durante a fase biotrófica da interação: 48 horas, 72 horas, 9 dias e 12 dias após a inoculação. Após análises de bioinformática foram selecionados 75 genes e as análises de RT-PCR confirmaram a origem fúngica de 62 genes HvECs. Desses, 22 HvECs são preferencialmente expressos durante a interação com o cafeeiro, apresentando padrões distintos de expressão durante a fase biotrófica da interação. Adicionalmente, desenvolveu-se um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, por meio do sistema pEDV e do Sistema de Secreção Tipo III de P. syrigae pv. garcae. A expressão transiente do gene HvEC-016 no citoplasma de cafeeiros resistentes à ferrugem, portadores do gene SH1, desencadeou uma resposta de defesa das plantas, indicando que pode ter ocorrido o reconhecimento da proteína efetora HvEC-016 mediada pela proteína R codificada pelo gene SH1. Esse sistema de expressão transiente e o catálogo de genes candidatos a efetores de H. vastatrix expressos tanto durante a germinação dos urediniósporos como na interação com o cafeeiro, disponibilizados por esse estudo, constituem uma importante plataforma para a identificação de outros genes de avirulência de Hemileia vastatrix.