Ciências Agrárias
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Item Identificação e análise funcional de efetores de Hemileia vastatrix, agente causal da ferrugem do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-27) Maia, Thiago Andrade; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785633J8; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Brommonschenkel, Sérgio Hermínio; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780948Y4; http://lattes.cnpq.br/6798704880640812; Resende, Mário Lúcio Vilela de; http://lattes.cnpq.br/8921922898103482; Barreto, Robert Weingart; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783300H6; Cunha, Luis Claudio Vieira da; http://lattes.cnpq.br/9367947173322278; Pacheco, Jorge Luis Badel; http://lattes.cnpq.br/4921932550244295A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é o principal problema fitossanitário da cafeicultura, podendo ocasionar perdas da ordem de 35 a 50% da produção se não forem implantadas medidas de controle. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugens secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Já foram identificados geneticamente pelo menos nove genes dominantes (SH1 a SH9) que conferem resistência à ferrugem do cafeeiro, no entanto, apesar de muitos anos de pesquisa neste patossistema, os genes Avr complementares de H. vastatrix ainda não foram identificados ou caracterizados. Uma abordagem que pode ser realizada com esta finalidade é a análise do transcriptôma e de bioinformática para identificar genes candidatos de H. vastatrix que cumpram uma lista de critérios específicos em banco de dados de sequências, seguida da validação por meio de ensaios funcionais para atividades de efetores. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: (i) identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas, expressas durante a germinação dos urediniósporos e também durante a fase biotrófica da interação com o cafeeiro; (ii) expressar genes candidatos a efetores de H. vastatrix, utilizando o sistema armadilha de secreção em levedura YST (Yeast Secretion Trap) para confirmação biológica da predição de secreção realizada por ferramentas de bioinformática; (iii) analisar a estrutura genômica dos genes candidatos a efetores selecionados; (iv) efetuar a análise da expressão temporal dos genes identificados durante as diferentes fases da patogênese; (v) estabelecer um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, com base no Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae. Inicialmente, caracterizou-se o secretoma de urediniósporos germinados de H. vastatrix por meio da construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA isolado de urediniósporos germinados in vitro por 16 horas. Após análises das sequências por ferramentas de bioinformática, foram selecionadas 146 ORFs que codificam proteínas secretadas. Durante a anotação dessas sequências constatou-se que 20% do secretoma de urediniósporos germinados são constituídos por enzimas hidrolíticas e que a maioria (67%) das proteínas secretadas identificadas possui função desconhecida. A partir dessas sequências foram selecionadas 35 ORFs completas que codificam proteínas com características comuns aos efetores de fungos filamentosos, denominados genes candidatos a efetores de H. vastatrix (HvECs H. vastatrix effector candidates). Desses, 22 HvECs tiveram suas sequências genômicas caracterizadas, confirmando as ORFs preditas por bioinformática. A secreção de oito HvECs selecionados foi comprovada em levedura, e sua expressão diferenciada, que possivelmente ocorre com as mudanças morfológicas do desenvolvimento do patógeno nos estágios inicias de infecção, foi comprovada por meio RT-qPCR. Posteriormente, caracterizou-se o secretoma de H. vastatrix expresso durante uma interação compatível com o cafeeiro, por meio da combinação de sequenciamento Sanger e pirossequenciamento 454. Esta abordagem integrada permitiu o sequenciamento massivo de um substancial número de etiquetas de sequências expressas (ESTs) em folhas de café infectadas com H. vastatrix, amostradas em quatro tempos diferentes durante a fase biotrófica da interação: 48 horas, 72 horas, 9 dias e 12 dias após a inoculação. Após análises de bioinformática foram selecionados 75 genes e as análises de RT-PCR confirmaram a origem fúngica de 62 genes HvECs. Desses, 22 HvECs são preferencialmente expressos durante a interação com o cafeeiro, apresentando padrões distintos de expressão durante a fase biotrófica da interação. Adicionalmente, desenvolveu-se um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, por meio do sistema pEDV e do Sistema de Secreção Tipo III de P. syrigae pv. garcae. A expressão transiente do gene HvEC-016 no citoplasma de cafeeiros resistentes à ferrugem, portadores do gene SH1, desencadeou uma resposta de defesa das plantas, indicando que pode ter ocorrido o reconhecimento da proteína efetora HvEC-016 mediada pela proteína R codificada pelo gene SH1. Esse sistema de expressão transiente e o catálogo de genes candidatos a efetores de H. vastatrix expressos tanto durante a germinação dos urediniósporos como na interação com o cafeeiro, disponibilizados por esse estudo, constituem uma importante plataforma para a identificação de outros genes de avirulência de Hemileia vastatrix.