Fisiologia Vegetal
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Item Importância fisiológica dos transportadores mitocondriais de adenilatos AACs em Arabidopsis thaliana(Universidade Federal de Viçosa, 2019-03-11) Batista, Amanda Lima; Nesi, Adriano Nunes; http://lattes.cnpq.br/5734266643442378A mitocôndria é a organela responsável pela maior parte do fornecimento do ATP necessário para os processos metabólicos de manutenção do crescimento e respostas a vários estresses. O transporte de adenilatos (AMP, ADP e ATP) através da membrana mitocondrial interna é mediado por proteínas carreadoras especializadas, dentre as quais se encontram os carreadores do tipo antiporte ADP/ATP (AAC), que exportam o ATP para o citosol e, simultaneamente, importam o ADP para a matriz mitocondrial. Em Arabidopsis thaliana, são encontradas as isoformas AAC1, AAC2 e AAC3, cujos papeis fisiológicos ainda permanecem desconhecidos. Neste trabalho, avaliou-se em Arabidopsis thaliana o papel dos transportadores mitocondriais de ADP/ATP, denominados AtAAC1, AtAAC2 e AtAAC3. Para tal, foram utilizadas linhagens mutantes homozigotas com baixa expressão obtidas por inserção do T-DNA. Estas plantas foram caracterizadas a nível fisiológico e bioquímico. A análise do padrão de expressão dos genes AACs em plantas selvagens em condições ideais de cultivo demonstrou que de fato eles provavelmente desempenham papeis fisiológicos distintos em função do tecido e estágio do desenvolvimento. O gene AAC1 se apresentou como a isoforma mais abundante, independente do tecido e estágio do desenvolvimento. O AAC2 e o AAC3 tiveram expressão mais relevante em tecidos relacionados à fase reprodutiva, tais como grãos de pólen, flores e síliquas. Análise da expressão demonstrou que, na ausência do gene AAC2, ocorre regulação positiva dos demais transportadores de adenilatos da célula. Os mutantes para os genes AAC1, AAC2 e AAC3 exibiram maiores taxas de respiração noturna em relação a plantas WT sem apresentarem alterações na assimilação líquida de carbono e no crescimento. Adicionalmente, a quantificação metabólica nas plantas mutantes das três isoformas apontou tendência de maior acúmulo nos teores de aminoácidos, proteínas, glicose, frutose, sacarose e amido ao longo do período luminoso e alto consumo dos mesmos durante o período noturno. Também foram observadas maiores razões de poder redutor [NAD(P)H/NAD(P) + ] em mutantes para o gene AAC1, AAC2 e AAC3 comparado ao WT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que, esses transportadores ADP/ATP estão envolvidos principalmente no metabolismo do processo respiratório, balanço redox e concentrações de metabólitos nitrogenados e carbonados. Assim, pode-se sugerir que a dinâmica distribuição das moléculas de adenilato, promovida por estes transportadores, tenha vipapeis relevantes na sincronia entre o metabolismo diurno e noturno em plantas, contribuindo assim para a manutenção do steady-state celular, por mecanismos que precisam ser investigados. Para tal, é necessário, aprofundar a compressão do papel destes transportadores nos tecidos vegetais e condições adversas bem como o papel de enzimas chave que atuam no processo.Item The role of NAD+ compartmentation and dynamics in Arabidopsis thaliana(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-19) Araujo, Elias Feitosa; Nesi, Adriano Nunes; http://lattes.cnpq.br/4607484418104157Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a fundamental coenzyme required to regulate plant central metabolism and redox status homeostasis. Plants produce NAD+ via de novo and salvage pathways. Despite early steps of the two pathways occur in different subcellular compartments, de novo in chloroplasts and salvage in cytosol, both pathways produce the final product NAD+ exclusively in the cytosol. Thus, NAD+ must be imported into organelles to drive biological processes inside them. In Arabidopsis thaliana, three genes have been identified as NAD+ carriers, namely NDT1 (At2g47490) and NDT2 (At1g25380), both targeted to the inner mitochondrial membrane, and the peroxisomal transporter PXN (At2g39970). The previous functional characterization of NDT1, NDT2 and PXN have revealed their importance for seed production and quality, seedling establishment, photosynthesis, metabolism, stomatal density and stomatal conductance. To extend our knowledge on the importance of NAD+ dynamics, we used mutants for NAD+ transport and focused in comprehend: (1) how altered NAD + distribution affects stomatal development in cotyledons, (2) the crosstalk between NAD+ transport and elevated atmospheric CO2 concentration and (3) NAD + dynamics in vivo under different environmental cues. The results indicate that NAD negatively regulates stomatal development in cotyledons of Arabidopsis. Seedlings with reduced expression of mitochondrial (NDT1 and NDT2) and peroxisomal (PXN) NAD+ transporter genes displayed reduced numbers of stomata lineage cells and reduced stomatal density. Furthermore, cotyledons of wild- type seedlings treated with exogenous NAD+ and cotyledons of mutant plants with reduced NAD+ breakdown capacity also exhibited reduced stomatal number. Impaired NAD+ transport and the exogenous NAD+ feeding were further associated with the induction of abscisic acid (ABA)-responsive genes. Additionally, NAD+ feeding of aba- 2 and ost1 seedlings, impaired in ABA synthesis and ABA signaling, respectively, did not impact on stomatal number, whereas the inhibition of ABA synthesis rescued the stomatal phenotype in NAD+ carrier mutants. Moreover, in vivo measurement of ABA dynamics in seedlings of an ABA-specific optogenetic reporter - ABAleon2.1 treated with NAD+ showed increases in ABA content, suggesting that NAD+ impacts on stomatal development through ABA synthesis and signaling. The results demonstrate that intracellular NAD+ homeostasis is essential for normal stomatal development, and provide a link between central metabolism and developmental plasticity. Posteriorly, NAD+ carrier mutants were grown under elevated CO2 concentrations and overall results showed that, under high CO2 , the mutants displayed reductions in total biomass and leaf number compared to the control under ambient CO2 . Furthermore, higher levels of photorespiratory intermediates such as glutamate and glycine were found in the mutant lines under elevated CO2 . Moreover, mutant lines produced much less seeds than wild-type plants regardless of CO2 concentration, demonstrating that NAD+ compartmentalization is fundamental during reproductive phase in both ambient and high CO2 concentration. With the aim to deeper study NAD + dynamics, we transformed wild-type and a ndt1 mutant line with the Peredox-mCherry sensor that permits the measuring of cytosolic NADH dynamics in vivo. The cytosol of ndt1 mutant lines presented higher levels of NADH/NAD + compared to the control line. Additionally, increased cytosolic levels of NADH/NAD+ in leaves of ndt1 mutants was observed upon the exogenous feeding of sugars and tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Surprisingly, light, mitochondrial electron transport chain (mETC) inhibitors and oxygen deprivation treatment did not show significant differences in cytosolic NADH/NAD+ content in ndt1 mutants compared to wild-type. The results provide evidence of disruption of NAD+ balance among organelles in ndt1 mutants and show the power of this technique to follow NADH dynamics in vivo. Collectively, the data presented provide different inputs to show that, not only NAD+ metabolism, but also NAD+ distribution across organelles, are fundamental to drive essential biological processes in plants. Furthermore, this study proposes a direct link between central metabolism and early developmental process such as stomatal development. Keywords: Nicotinamide adenine dinucleotide. NAD+ transport. Metabolism. Development.Item Importância fisiológica dos Transportadores Mitocondriais de Adenilatos AACs em Arabidopsis thaliana(Universidade Federal de Viçosa, 2019-03-11) Batista, Amanda Lima; Nesi, Adriano Nunes; http://lattes.cnpq.br/5734266643442378A mitocôndria é a organela responsável pela maior parte do fornecimento do ATP necessário para os processos metabólicos de manutenção do crescimento e respostas a vários estresses. O transporte de adenilatos (AMP, ADP e ATP) através da membrana mitocondrial interna é mediado por proteínas carreadoras especializadas, dentre as quais se encontram os carreadores do tipo antiporte ADP/ATP (AAC), que exportam o ATP para o citosol e, simultaneamente, importam o ADP para a matriz mitocondrial. Em Arabidopsis thaliana, são encontradas as isoformas AAC1, AAC2 e AAC3, cujos papeis fisiológicos ainda permanecem desconhecidos. Neste trabalho, avaliou-se em Arabidopsis thaliana o papel dos transportadores mitocondriais de ADP/ATP, denominados AtAAC1, AtAAC2 e AtAAC3. Para tal, foram utilizadas linhagens mutantes homozigotas com baixa expressão obtidas por inserção do T-DNA. Estas plantas foram caracterizadas a nível fisiológico e bioquímico. A análise do padrão de expressão dos genes AACs em plantas selvagens em condições ideais de cultivo demonstrou que de fato eles provavelmente desempenham papeis fisiológicos distintos em função do tecido e estágio do desenvolvimento. O gene AAC1 se apresentou como a isoforma mais abundante, independente do tecido e estágio do desenvolvimento. O AAC2 e o AAC3 tiveram expressão mais relevante em tecidos relacionados à fase reprodutiva, tais como grãos de pólen, flores e síliquas. Análise da expressão demonstrou que, na ausência do gene AAC2, ocorre regulação positiva dos demais transportadores de adenilatos da célula. Os mutantes para os genes AAC1, AAC2 e AAC3 exibiram maiores taxas de respiração noturna em relação a plantas WT sem apresentarem alterações na assimilação líquida de carbono e no crescimento. Adicionalmente, a quantificação metabólica nas plantas mutantes das três isoformas apontou tendência de maior acúmulo nos teores de aminoácidos, proteínas, glicose, frutose, sacarose e amido ao longo do período luminoso e alto consumo dos mesmos durante o período noturno. Também foram observadas maiores razões de poder redutor [NAD(P)H/NAD(P)+] em mutantes para o gene AAC1, AAC2 e AAC3 comparado ao WT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que, esses transportadores ADP/ATP estão envolvidos principalmente no metabolismo do processo respiratório, balanço redox e concentrações de metabólitos nitrogenados e carbonados. Assim, pode-se sugerir que a dinâmica distribuição das moléculas de adenilato, promovida por estes transportadores, tenha papeis relevantes na sincronia entre o metabolismo diurno e noturno em plantas, contribuindo assim para a manutenção do steady-state celular, por mecanismos que precisam ser investigados. Para tal, é necessário, aprofundar a compressão do papel destes transportadores nos tecidos vegetais e condições adversas bem como o papel de enzimas chave que atuam no processo.