Navegando por Autor "Xavier, Luciana Pereira"
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Item Caracterização bioquímica de proteases do intestino de Anticarsia gemmatalis envolvidas no mecanismo de interação planta-inseto(Universidade Federal de Viçosa, 2002-08-06) Xavier, Luciana Pereira; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/6207860145204571A identificação e caracterização de proteases de intestino médio de insetos são importantes para o desenvolvimento de cultivares resistentes ao ataque de insetos. Neste estudo, a atividade proteolítica em intestino médio de larvas de A. gemmatalis foi investigada. O extrato enzimático foi obtido após ciclos de congelamento e descongelamento dos intestinos e posterior centrifugação do homogenato a 100,000 g, e o sobrenadante resultante (Fração I) foi utilizado como fonte de proteína solúvel. Como parte de nossos estudos, envolvendo a identificação de proteases do intestino médio de larvas de of A. gemmatalis, a presença de enzimas ligadas a membrana foi avaliada. Para este propósito, o precipitado do homogenato de intestino médio centrifugado a 100,000 g. foi ressuspendido em tampão com Triton X-100, centrifugado como anteriormente e o sobrenadante (Fração II) usado como fonte de proteases ligadas à membrana. A Fração I foi capaz de hidrolisar a caseína, e o substratos sintéticos L -BApNA e TAME. Usando L - BApNA como substrato, a atividade da Fração I foi investigada na presença de vários inibidores de proteases. Assim, EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina, foram todos capazes de inibir a atividade da Fração I, com maior inibição observada com TLCK e benzamidina. De acordo com este resultados, conclui-se que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui uma serino protease trpsina-like. Com o propósito de caracterizar melhor a atividade tripsina-like, foi determinada a atividade ótima para a Fração I. O pH ótimo foi de 8.5 e à temperatura ótima foi a 35 o C, sobre L -BApNA. O pH ótimo e temperatura foi de 8.0 e 30 o C, sobre TAME. O efeito de cálcio na atividade da Fração I foi investigado usando L -BApNA como substrato. A atividade máxima foi obtida na concentração de 20 mM de cálcio. Valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.32mM e 52.5μM, respectivamente. A Fração II foi capaz de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos, L -BApNA e TAME. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L -BApNA como substrato. EDTA, PMSF, TLCK, benzamidina e aprotinina foram capazes de inibir a atividade da Fração II, com TLCK e benzamidina exibindo forte inibição. Estes resultados mostram que o intestino médio de larvas de A. gemmatalis possui proteases tripsin-like ligadas a membrana. Esta atividade tripsina-like foi melhor caracterizada. O pH ótimo para a Fração II usando L -BApNA e TAME foi 8.5 e 8.0, respectivamente. A atividade ótima exibida foi a 50 o C para ambos substratos, L-BApNA e TAME. Na concentração de 20 mM de cálcio, a Fração II mostrou um aumento na atividade sobre o L -BApNA. Os valores de K Mapp para L -BApNA e TAME foram de 0.23mM e 95.4 μM, respectivamente.Item Purificação parcial, propriedades e caracterização cinética de proteases tripsina-like do intestino médio da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis(Universidade Federal de Viçosa, 2006-08-31) Xavier, Luciana Pereira; Guedes, Raul Narciso Carvalho; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721108T2; Santoro, Marcelo Matos; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/index.jsp; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790894D6; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766584Y6; Moraes, Célia Alencar de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781007D6; Guia, Thiago Rennó dos Mares; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763600P2A identificação e caracterização de proteases do intestino médio de insetos são de grande importância para a pesquisa e desenvolvimento de cultivares resistentes às pragas agrícolas. Neste trabalho, foram realizados diferentes processos de purificação para proteases tripsina-like do intestino médio de A. gemmatalis, bem como a caracterização dessas proteases. Duas frações foram isoladas durante um dos processos de gel-filtração, a fração FI (aniônica), com atividade amidásica (substrato: L-BApNA) parcialmente purificada por troca iônica (coluna Mono-Q HR 5/5) e afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) apresentou em SDS-PAGE bandas com massas moleculares de 17,1 kDa a 65,4 kDa; a massa molecular de 17,1k Da provavelmente seja produto de hidrólise e a massa molecular de 65,4 kDa produto de agregação; a fração FII (aniônica) também parcialmente purificada por troca aniônica e afinidade exibiu duas bandas de 33,5 kDa e 31,3 kDa. Ensaio antimicrobiano realizado contra S. aureus e E. coli indicou resultado negativo para o extrato enzimático e para amostra parcialmente purificada de FII. Em ensaio com L. monocystogenes e E. faecalis, o resultado foi positivo para o extrato enzimático e negativo para a amostra parcialmente purificada de FII. Em um segundo processo de purificação, uma serino protease tripsina-like catiônica com massa moleculare de 30 kDa (SDS-PAGE) foi purificada do intestino médio de A. gemmatalis pela combinação de cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina), cromatografia de troca catiônica (coluna Mono-S HR 5/5), em sistema de FPLC e cromatografia de fase reversa (coluna de C-18), em sistema de HPLC. A amostra catiônica parcialmente purificada por afinidade apresentou em SDS-PAGE, bandas com massas moleculares de 24,8 kDa, 26,3 kDa, 30 kDa, 33,4 kDa. A análise com PMSF, TLCK e TPCK, em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, indicou que as eszimas são serino proteases tripsina-like. Em teste de glicosilação, verificou-se que as proteases de 24,8 kDa e de 26,3 kDa são glicosiladas. A atividade específica encontrada foi de 13,2 μM.s-1.μg-1 e o fator de purificação, de 123,4 vezes. Na determinação cinética, o valor de KM app encontrado para as tripsinas-like catiônicas após cromatografia de troca iônica foi de 0,46 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado em cromatografia de fase reversa em HPLC, detectaram-se as massas de 1.750,8 Da (ESI-TOF), 7.997,23 Da (MALDI-TOF) e 23.324,74 Da (ESI-TOF), sugerindo a degradação deste material durante o processamento