Navegando por Autor "Ribeiro, João Batista"
Agora exibindo 1 - 6 de 6
- Resultados por Página
- Opções de Ordenação
Item Development of a transformation system for Penicillium brevicompactum based on the Fusarium oxysporum nitrate reductase gene(Brazilian Journal of Microbiology, 2005-04) Queiroz, Marisa Vieira de; Pereira, Jorge Fernando; Ribeiro, Ronney Adriano; Soares, Marcos Antônio; Ribeiro, João Batista; Araújo, Elza Fernandes de; Varavallo, Maurílio AntônioPenicillium brevicompactum is a filamentous fungus that presents a potential for industrial use due its efficient pectinase production. A heterologous transformation system was developed for P. brevicompactum based on the complementation of a nitrate reductase mutant. Nitrate reductase mutants were obtained by resistance to chlorate in a rate of 23.24% when compared to other mutations that lead to the chlorate resistance. One mutant named 4457-18X was chosen for the transformation experiments with the pNH24 vector containing de Fusarium oxysporum nitrate reductase gene. A frequency of approximately 3 transformants/µg DNA was obtained using the circular vector pNH24. This frequency was multiplied about 10 fold using the linearized vector with the Xba I restriction enzyme. Southern analysis of the transformants showed a tendency of the linearized vector to diminish the number of integrations compared to the use of the circular vector. The integration was random and stable in the analyzed transformants. The establishment of a transformation system for P. brevicompactum is fundamental for genetic manipulation of this microorganism.Item Gel mobility shift scanning of pectin-inducible promoter from Penicillium griseoroseum reveals the involvement of a CCAAT element in the expression of a polygalacturonase gene(Genetics and Molecular Biology, 2008-07-25) Ribon, Andréa de O.B.; Ribeiro, João Batista; Gonçalves, Daniel B.; Queiroz, Marisa V. de; Araújo, Elza F. dePrevious reports have described pgg2, a polygalacturonase-encoding gene of Penicillium griseoroseum, as an attractive model for transcriptional regulation studies, due to its high expression throughout several in vitro growth conditions, even in the presence of non-inducing sugars such as sucrose. A search for regulatory motifs in the 5' upstream regulatory sequence of pgg2 identified a putative CCAAT box that could justify this expression profile. This element, located 270 bp upstream of the translational start codon, was tested as binding target for regulatory proteins. Analysis of a 170 bp promoter fragment by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with nuclear extracts prepared from mycelia grown in pectin-containing culture medium revealed a high mobility complex that was subsequently confirmed by analyzing it with a double-stranded oligonucleotide spanning the CCAAT motif. A substitution in the core sequence for GTAGG partially abolished the formation of specific complexes, showing the involvement of the CCAAT box in the regulation of the polygalacturonase gene studied.Item Isolamento e caracterização de genes que codificam poligalacturonases e transformação de Penicillium expansum(Universidade Federal de Viçosa, 2001-03-20) Ribeiro, João Batista; Araújo, Elza Fernandes de; http://lattes.cnpq.br/9402576530378874A seqüência completa de nucleotídeos do gene pepg1 foi determinada. A análise desta seqüência mostrou que este gene apresenta dois possíveis introns de 58 pares de bases, um potencial cis elemento TATA na posição -151 e um potencial CAAT Box na posição -273. A região codificadora contém 1110 pb, após a retirada dos introns, e a partir dessa seqüência foi deduzida uma proteína com 370 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos apresenta grande homologia com poligalacturonases de outros fungos filamentosos, com massa molecular deduzida de 38,4 KDa e ponto isoelétrico teórico de 8,31. Quatro fagos recombinantes foram isolados a partir do banco genômico de Pencillium expansum, utilizando-se como sonda um fragmento de DNA de 1,6 Kb contendo o gene pgg1 de P. griseoroseum, os quais foram denominados λPEPG1, λPEPG2, λPEPG3 e λPEPG4. Os fagos λPEPG3 e λPEPG4 apresentaram fragmentos genômicos clonados de 14,5 e 16,6 Kb. Fragmentos de DNA de Bam HI de 3,6 e 5,1 Kb dos fagos λPEPG3 e λPEPG4 respectivamente, que hibridizaram com a sonda, foram subclonados no vetor pBluescript® SK+, originando os plasmídeos recombinantes pEPG3 e pEPG4. O gene pepg1 foi usado na transformação de protoplastos do mutante nia/pab/faw de P. expansum na presença de polietilenoglicol e CaCl2. Para a seleção dos transformantes, em meio mínimo contendo nitrato de sódio como fonte de nitrogênio, foi usado o gene nia de Fusarium oxysporum. Cento e cinqüenta e cinco, dentre os 234 transformantes obtidos, foram considerados estáveis quanto ao gene de nitrato redutase, e foram analisados quanto à produção de pectinase total em meio mineral sólido tamponado contendo pectina. Foram observadas linhagens transformantes apresentando halos de degradação da pectina maiores e menores que os da linhagem selvagem e mutante, mas a maioria dos transformantes apresentou resultado similar ao dessas linhagens. Cinqüenta e três transformantes foram caracterizados quanto à produção de poligalacturonase. Foram observados transformantes com atividade de PG inferior à da linhagem selvagem, mas a maioria dos transformantes analisados apresentou aumento na atividade dessa enzima, variando de 10 a 89 % em relação à linhagem selvagem. A hibridização do DNA total dessas linhagens, clivado com enzimas de restrição, revelou a ocorrência de integração heteróloga e de múltiplas cópias em tandem do gene pepg1 no genoma de P. expansum.Item Obtenção de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum para produção de poligalacturonase(Universidade Federal de Viçosa, 2005-12-09) Ribeiro, João Batista; Araujo, Elza Fernandes de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4707778D1; Queiroz, Marisa Vieira de; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4785812Z5; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Dias, Eustáquio Souza; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4769445U0; Schwan, Rosane Freitas; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4721861H8Análise de um fragmento de DNA de 170 pb da região promotora do gene pgg2 contendo um possível CCAAT-box localizado a -270 pares de bases (pb) do códon de início da tradução, por meio de ensaios de migração retardada em gel, revelou a formação de complexos específicos deste fragmento de DNA com proteínas nucleares obtidas a partir de micélio cultivado em meio contendo pectina. A ligação de proteínas no elemento CCAAT foi confirmada quando a análise foi realizada utilizando um oligonucleotídeo fita dupla contendo essa seqüência. Substituição da seqüência original pela seqüência GTAGG diminuiu a formação de complexos específicos, comprovando o envolvimento do elemento CCAAT na regulação da expressão do gene pgg2. Um oligonucleotídeo de 23 pb contendo a seqüência CTACAGTG, similar à seqüência de um cis-elemento de resposta a AMPc encontrado em promotores de leveduras e mamíferos, também foi usado como sonda em ensaios de migração retardada em gel. Complexos de DNA-proteínas não foram detectados quando se utilizou extratos protéicos nucleares, preparados a partir de micélio cultivado em glicose e extrato de levedura, sugerindo que o elemento CTACAGTG não representa um sítio para a ligação de proteínas ativadoras. Foi construído um vetor para inativação do gene pgg2 de P. griseoroseum, denominado pPG15pgg2Δniafo, o qual contém o gene pgg2 interrompido por um fragmento de DNA de 4,0 Kb, correspondente ao gene nia de Fusarium oxysporum. A inativação do gene pgg2, demonstrou que a poligalacturonase codificada por este gene é responsável por 90 % da atividade total de PG de P. griseoroseum. Foi construído um vetor para expressão do gene pgg2 sob o controle do promotor constitutivo do gene gpdA de Aspergillus nidulans, o qual foi utilizado na transformação da linhagem PG63 de P. griseoroseum. Foram obtidas linhagens transformantes que, quando cultivadas na presença de glicose, sacarose ou caldo de cana, apresentaram aumento na atividade de PG de até 12 vezes em relação à linhagem PG63 cultivada em pectina e extrato de levedura. A linhagem recombinante 146 apresentou aumento na atividade de PG quando cultivada em meio contendo glicose (1%) por 48 a 96 horas, utilizando-se 106 ou 107 conídios/mL do meio de cultura. Embora tenha sido observado menor massa micelial seca, quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em sacarose e caldo de cana, a atividade de PG foi de 90 % da determinada quando estas linhagens foram cultivadas em glicose. A poligalacturonase produzida pela linhagem recombinante 146 de P. griseoroseum apresentou alta atividade na faixa de pH de 3,5 a 5,0 e nas temperaturas de 30 a 60oC, sendo estável quando armazenada por pelo menos 5 semanas nas temperaturas de -20, 4 e 30oC. No entanto, apresentou baixa termoestabilidade, sofrendo desnaturação quando pré- incubada por 1 hora nas temperaturas de 40, 50 e 60oC. Os níveis enzimáticos relatados neste trabalho e as propriedades físico-químicas da PG II produzida pela linhagem recombinante 146 de P. griseoroseum demonstram a eficiência do sistema de expressão desenvolvido e que a PG II é uma enzima adequada para aplicação na indústria de processamento de sucos de frutas.Item Overexpression of the plg1 gene encoding pectin lyase in Penicillium griseoroseum(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2007-11-12) Teixeira, Janaina Aparecida; Ribeiro, João Batista; Teixeira, Janaina Aparecida; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes deThe pectin lyase (PL) is an industrially important enzyme since it is used for maceration and clarification in the process of fruit juice production in food industries. In order to increase the yields of pectin lyase we cloned the plg1 (pectin lyase 1) from Penicillium griseoroseum gene under the control of the strong constitutive promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpdA) and the terminator region of the tryptophan synthetase (trpC) gene from Aspergillus nidulans (plasmid pAN52-Plg1) and transformed this construct into the P. griseoroseum strain PG63. One of the pAN52-Plg1 multi-copy transformants (strain 105) grown in culture medium containing glucose or sugar cane juice showed PL activities of 4,804 or 5,202 U ml−1 respectively, which represented 57- and 132-fold increases. In addition, the apparent specific activity of PL produced by this strain was much higher than the one observed for a commercial pectinase preparation. Evaluation of the extracellular proteins in the culture supernatant of strain 105 by SDS-PAGE showed the presence of a clear and strong band of approximately 40 kDa that probably corresponds to PL. The enzyme yields reported here demonstrate that the system we developed is able to express pectin lyase at levels comparable to, or exceeding, previously reported data.Item Overproduction of polygalacturonase by Penicillium griseoroseum recombinant strains and functional analysis by targeted disruption of the pgg2 Gene(Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013-01-14) Teixeira, Janaina Aparecida; Ribeiro, João Batista; Gonçalves, Daniel Bonoto; Queiroz, Marisa Vieira de; Araújo, Elza Fernandes deInactivation of the pgg2 gene, a polygalacturonase-encoding gene from Penicillium griseoroseum, reduced the total activity of polygalacturonase (PG) by 90 % in wild-type P. griseoroseum, which indicates that the pgg2 gene is the major gene responsible for PG production in this species. To increase PG production, the coding region of the pgg2 gene was cloned under the control of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (gpd) promoter and the terminator region of the tryptophan synthase (trpC) gene from Aspergillus nidulans (pAN52pgg2 vector). This vector was then used to transform P. griseoroseum. The transformed strains were characterized according to PG production using glucose, sucrose, or sugar cane juice as the carbon sources. The recombinant P. griseoroseum T146 strain contained an additional copy of the pgg2 gene, which resulted in a 12-fold increase in PG activity when compared with that detected in the supernatant of the control PG63 strain. The proteins secreted by the recombinant strain T146 showed a strong band at 38 kDa, which corresponds to the molecular weight of PG of the P. griseoroseum. The results demonstrate the significant biotechnological potential of recombinant P. griseoroseum T146 for use in PG production.