Navegando por Autor "Lopes, Mariana Rocha"
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Item Avaliação da concentração de proteínas e da atividade de α-galactosidases nos cotilédones e no eixo embrionário de sementes de Dalbergia nigra durante a germinação(Acta Amazonica, 2011) Carrijo, Lanna Clicia; Borges, Eduardo Euclydes de Lima e; Rezende, Sebastião Tavares de; Pontes, Cláudia Aparecida; Silva, Aderlan Gomes da; Lopes, Mariana RochaEste trabalho teve como objetivos a quantificação de proteínas e da atividade da enzima α-galactosidase, no eixo embrionário e nos cotilédones, de sementes de Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia) durante a germinação. As sementes foram colocadas para embeber em água por sete dias, sendo retiradas amostras para a avaliação bioquímica e cinética da enzima. A atividade da enzima α-galactosidase aumenta com a embebição das sementes nos dois compartimentos, embora não esteja presente no eixo embrionário de sementes secas. A diferença na atividade da enzima entre os cotilédones e o eixo embrionário foi significativa. O pH 5,5 foi o de máxima atividade para as enzimas de ambos os compartimentos. A temperatura que mais estimulou a atividade da enzima nos cotilédones foi 50 ºC e de 50 a 60 ºC no eixo embrionário. A atividade da α-galactosidase foi inibida por β-mercaptoetanol e cobre, em ambos os compartimentos, enquanto a lactose e o cloreto de sódio estimularam a atividade tanto nos cotilédones como no eixo embrionário. Os valores de KM para enzimas do eixo embrionário e dos cotilédones foram de 0,239 e 0,228 mM, respectivamente.Item Identificação e purificação de uma β-glicosidase extracelular e construção de vetores para expressão constitutiva de celulases em Kluyveromyces marxianus UFV-3(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-21) Lopes, Mariana Rocha; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6; Fietto, Luciano Gomes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8; http://lattes.cnpq.br/8233615798415589; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/4037452920080174; Guimarães, Valéria Monteze; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4798758T3; Oliveira, Leandro Licursi de; http://lattes.cnpq.br/0578231392218162Kluyveromyces marxianus é uma levedura com muitas características desejáveis para o desenvolvimento de um eficiente processo de produção de etanol a partir da sacarificação e fermentação simultâneas de biomassas: elevada taxa de crescimento, utilização de uma ampla variedade de açúcares, eficiente sistema de secreção de proteínas e a capacidade de fermentação em temperaturas próximas a 42ºC. A expressão heteróloga de celulases termoestáveis em K. marxianus têm sido o foco de várias pesquisas. O vetor pKLAC1-adh2p, para expressão constitutiva de celulases em K. marxianus, foi construído no Laboratório de Biotecnologia Molecular (LBM/UFV). Neste trabalho o gene de uma β-glicosidase de Aspegillus niger foi clonado e inserido no pKLAC1-adh2p. O cassete de expressão, pKLAC1-adh2p-bgl1, foi utilizado para transformação de K. marxianus UFV-3, porém o processo de seleção não foi eficiente e, durante a triagem por leveduras transformantes, foi observada a capacidade da levedura K. marxianus de secretar uma β-glicosidase. Dessa forma, enquanto trabalhos de padronização de um eficiente sistema de expressão heteróloga em K. marxianus vêm sendo desenvolvidos no laboratório (LBM/UFV), esta β-glicosidase extracelular de K. marxianus foi caracterizada. A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para otimizar o processo de produção e determinar os parâmetros pH e temperatura ótimos para a atividade da β-glicosidase extracelular. As melhores condições do meio para produção foram 4% de glicose, pH 5,5 e incubação a 35°C. A maior atividade enzimática foi obtida em pH 5,5 e 55°C. Ensaios de termoestabilidade determinaram uma meia-vida de 4 horas para a enzima, quando incubada a 60°C. A análise de especificidade por substratos mostrou que a enzima foi capaz de hidrolisar celobiose, p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo, o-nitrofenil-β-Dglicopiranosídeo, p-nitrofenil-β-cellobiosídeo e p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo. A enzima foi purificada por eletroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (PAGE) e análise de zimograma. A análise por SDS-PAGE revelou duas bandas majoritárias em torno de 45 KDa, que foram submetidas à digestão tríptica em gel e analisadas por espectrometria de massas (MS/MS). A proteína foi identificada como uma β-glicosidase. Para finalizar este trabalho, a β-glicosidase foi purificada por ultrafiltração e cromatografia de troca aniônica. O processo de purificação foi acompanhado por ensaio enzimático utilizando p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato e SDS-PAGE. Estes resultados mostram pela primeira vez uma β- glicosidase secretada por uma levedura fermentadora, isto abre a possibilidade para o uso de desta levedura para produção de etanol celulósico, já que os custos com a utilização de celulases ainda inviabilizam economicamente o processo.