Navegando por Autor "Carolino, Sônia Madali Boseja"
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Item Caracterização biológica e purificação da proteína BiP da soja (Glycine max (L.) Merrill)(Universidade Federal de Viçosa, 1997-07-25) Carolino, Sônia Madali Boseja; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4252852403677230A proteína BiP, residente no lúmen do retículo endoplasmático (RE), tem sido descrita como um componente importante no processo de dobramento e montagem de proteínas secretórias recém-sintetizadas. Com base na localização subcelular, identidade imunológica, massa molecular relativa e síntese constitutiva, foi possível identificar o homólogo de BiP da soja, usando-se anticorpos preparados contra BiP do milho. A análise do padrão de acúmulo da proteína BiP revelou que a sua síntese é coordenada, temporalmente, com a síntese de proteínas de reserva na semente. Além disso, a síntese de BiP é correlacionada com a concentração de proteína total acumulada na semente de diferentes variedades de soja. Esses resultados indicam que a proteína BiP é induzida pelo aumento da atividade secretória do cotilédone, associada à síntese ativa de proteínas de reserva. Consistente com sua função de chaperone molecular, BiP é induzida em resposta a diversos estresses fisiológicos que promovem a proliferação do RE e o acúmulo de proteínas mal dobradas nesta organela. Infestação por Tetranichus urticae e infecção por Cercospora sojina Hara induziram a síntese de BiP em níveis comparáveis. Similarmente, sua síntese foi induzida, significativamente, em resposta a estresse nutricional. Ao contrário de BiP de espinafre, BiP de soja é regulada positivamente por estresse hídrico. Esses resultados contraditórios indicam que vias distintas de mecanismos regulatórios controlam a expressão dos genes BiP em plantas. Como membro da família Hsp70, foi demonstrado que a proteína BiP da soja se liga a ATP e associa-se com polipeptídios sintetizados exclusivamente na semente. No entanto, o complexo formado entre BiP e esses polipeptídios é altamente estável e insensível a ATP. A propriedade de BiP de se ligar a ATP foi explorada como meio de purificar essa proteína a partir de extratos protéicos de sementes, usando-se cromatografia de afinidade em resinas de ATP-agarose. Conforme julgado através de géis de acrilamida corados com prata, BiP foi purificada em um nível de homogeneidade em torno de 90%. A identidade da proteína purificada foi confirmada, uma vez que seus anticorpos reconheceram eficientemente a proteína expressa pelo clone cUFVBiP1, que codifica BiP da soja.Item Caracterização funcional da proteína BiP de soja induzida por estresse osmótico e déficit hídrico(Universidade Federal de Viçosa, 2001-12-28) Carolino, Sônia Madali Boseja; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/4252852403677230O chaperone molecular residente do retículo endoplasmático (RE), denominado BiP “Binding Protein”, é membro da classe Hsp70 de proteína de estresse, sendo regulado em resposta a condições de estresse do RE, como acúmulo de proteínas desdobradas e desequilíbrio na homeostase de cálcio. Em condições normais, BiP de mamíferos sofre fosforilação e oligomerização. As modificações de BiP de mamíferos são restritas à forma oligomérica, sendo que a forma monomérica inalterada representa a espécie ativa. Recentemente, foi demonstrado que BiP de soja existe como formas fosforiladas e desfosforiladas interconversíveis, e o equilíbrio pode ser deslocado em qualquer direção em respostas a diferentes estímulos. Em contraste com o tratamento com tunicamicina, o estresse osmótico estimula a fosforilação das espécies de BiP em cultura de células de soja. Nesta investigação foi demonstrado que, independentemente do seu estado de oligomerização, as isoformas de BiP de folhas, sob déficit hídrico, exibem atividade de ligação a proteínas, indicando que a regulação de BiP de plantas pode diferir de outros eucariotos. Foi também caracterizado o estado de oligomerização das isoformas de BiP de soja induzidas por estresse osmótico e tunicamicina. Assim como em células de mamíferos, tanto a forma oligomérica como a monomérica foram detectadas em células de soja não-estressadas. A desfosforilação de BiP mediada por tunicamicina é acompanhada pela conversão da forma oligomérica para a monomérica. Entretanto, a forma fosforilada de BiP induzida por estresse osmótico existe predominantemente como espécie monomérica. Esses resultados indicam que a fosforilação de BiP induzida por estresse osmótico não media a oligomerização da proteína, e pode ter uma função regulatória distinta. A função protetora de BiP em planta foi examinada em condições de estresse hídrico. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum expressando constitutivamente níveis elevados de BiP ou seu cDNA anti-senso foram sujeitas à condição de déficit hídrico progressivo. Elevados níveis de BiP nas linhagens senso conferiram tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Sob seca progressiva, os níveis de BiP foliar correlacionaram com a manutenção da turgescência celular e com o conteúdo de água da parte aérea. O efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico foi anulado pela repressão anti-senso. Embora a superexpressão de BiP previna a desidratação celular, a condutância estomática e a taxa transpiratória em folhas senso estressadas foram superiores em relação às folhas controles e anti-senso. Em plantas anti-senso, a indução do sistema de defesa antioxidativo foi maior do que nas plantas controle, enquanto que em folhas senso estressadas a indução da atividade da superóxido dismutase não foi observada. Coletivamente, esses resultados evidenciam que a superexpressão de BiP em plantas pode conferir tolerância à seca, prevenindo o estresse oxidativo endógeno.