Indução e recuperação do estado viável não cultivável de Salmonella enterica e Shigella flexneri

Abstract

O estado viável não cultivável (VNC) foi verificado em diversas espécies de micro- organismos, muitas das quais são patógenos de importância alimentar, tais como Salmonella e Shigella. Nesta condição, os micro-organismos perdem a capacidade de crescer nos meios de cultura convencionais, mas mantém viabilidade quando analisados por técnicas de contagem direta, como microscopia. Salmonella e Shigella podem entrar nesta condição fisiológica como mecanismo de resposta as variações ambientais e recuperar culturabilidade quando as condições de sobrevivência forem novamente favoráveis. Neste trabalho, foi acompanhado o comportamento de Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 578 e Shigella flexneri durante a indução ao estado VNC, além de avaliar estratégias de reativação celular. Após a entrada no estado VNC por estresse nutricional, associado ao osmótico e baixa temperatura ou ao estresse oxidativo, as células foram submetidas a diversos tratamentos de recuperação, utilizando a combinação de alguns fatores, tais como meios de cultura, temperatura de incubação, agentes antioxidantes, condição atmosférica e métodos de esterilização dos meios. S. flexneri mostrou-se mais resistente às condições de estresses as quais foram expostas para indução ao estado VNC, pois células cultiváveis foram detectadas em meio de cultura após 277 dias sob os estresses nutricional, osmótico e frio, ao passo que Salmonella Enteritidis perdeu a culturabilidade em caldo BHI, após 133 dias de indução por estes mesmos agentes estressantes. Sob condições de estresse oxidativo, este sorovar não apresentou crescimento em TSA após 3 horas de indução, enquanto S. flexneri foi capaz de crescer após este mesmo período de tratamento. Análises por citometria de fluxo revelaram a presença de células viáveis de ambas espécies sob as condições de estresses utilizadas para indução ao estado VNC, entretanto, não foi possível recuperar a culturabilidade destas células utilizando as condições propostas, nas quais diversos fatores foram combinados totalizando assim 69 tratamentos de recuperação. Além disso, não foi observada diferença da presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular entre células em estado VNC e células viáveis em fase estacionária de crescimento em ambas espécies estudadas.

The viable but nonculturable state (VBNC) has been established in several species of microorganisms, many of which are foodborne pathogens, such as Salmonella and Shigella. In this condition, microorganisms lose the ability to grow in conventional culture media but maintain viability when analyzed by direct counting techniques, such as microscopy. Salmonella and Shigella may enter into this physiological condition as a mechanism of response to environmental variations and recovery culturability when survival conditions are again favorable. This work verified the behavior of Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 578 and S. flexneri during induction to VBNC state and the use of resuscitations techniques. After entry into the VNC state by cold induction, osmotic and nutritional stresses or oxidative stress, cells were submitted to various recovery treatments using a combination of some factors such as culture media, incubation temperature, antioxidant agents, atmospheric condition and media sterilization methods. S. flexneri was more resistant to stress conditions once cultivable cells were detected in culture medium after 277 days under cold, osmotic and nutritional stresses, whereas Salmonella Enteritidis lost culturability in BHI broth, after 133 days of induction by these same stressful conditions. Under oxidative stress, this serovar did not growth in TSA after 3 hours of induction, while S. flexneri was able to grow after this same treatment period. Flow cytometric analysis revealed the presence of viable cells from both species under conditions of induction stresses to the VNC state, however, it was not possible to recover the culturability of these cells using the proposed conditions, in which the various factors were combined, thus totaling 69 recovery treatments. In addition, no difference was observed in the presence of intracellular reactive oxygen species (ROS) between VNC cells and viable cells in the stationary phase of growth in both species studied.