Lipopeptídeos de Bacillus velezensis como biofungicidas: identificação, biossíntese, atividade antifúngica e controle de doenças foliares

Abstract

Bactérias do gênero Bacillus, em particular aquelas do grupo Bacillus subtilis, são amplamente empregadas no biocontrole de doenças da parte aérea das plantas. A eficácia de controle é atribuída à atividade antimicrobiana dos lipopeptídeos (LPs), metabólitos secundários majoritários produzidos por estas bactérias. Os LPs são moléculas bioativas de natureza anfifílica e se dividem em três principais famílias: iturinas, fengicinas e surfactinas. Estirpes eficientes no biocontrole comumente coproduzem as três famílias de LPs em um perfil metabólico diversificado. Esses compostos são produzidos de forma natural durante o cultivo bacteriano e compõem a formulação de biofungicidas à base de Bacillus spp. Os objetivos deste estudo foram aumentar a produção de LPs, realizar a caracterização química e biossintética destes, e avaliar a eficácia de produtos enriquecidos com LPs de duas estirpes de Bacillus velezensis, B157 e UCBB48, na inibição de fungos fitopatogênicos e no controle de doenças foliares. Em um primeiro estudo, o extrato orgânico enriquecido com LPs da estirpe B157 foi utilizado de forma eficaz no controle da pinta preta do tomateiro, em condições controladas. Vinte e sete lipopeptídeos, das famílias biossintéticas das surfactinas, iturinas e fengicinas, foram detectados no perfil químico de B157, sendo a atividade antifúngica associada à presença das duas últimas famílias de LPs. Em um segundo estudo, a estirpe UCBB48, possuidora de um perfil de metabólitos similar ao de B157, foi usada em experimentos de otimização de cultivo para o aumento do rendimento de concentrado de LPs. O meio líquido selecionado, à base de farelo de soja, proporcionou rendimentos médios de 1 g/L de concentrado. Tentativas de aumento da escala de produção em fermentador de 10 L resultaram em rendimentos inferiores a 1 g/L. A atividade antifúngica do produto concentrado em LPs de UCBB48 foi comprovada em ensaios in vitro contra três patógenos foliares da soja, Colletotrichum truncatum, Corynespora cassiicola e Phakopsora pachyrhizi. Por fim, os genomas das estirpes B157 e UCBB48 foram sequenciados e comparados com genomas de outras estirpes brasileiras e de outras regiões geográficas. Oito clusters de genes associados à biossíntese de metabólitos secundários foram anotados no genoma das duas estirpes, mas somente a produção LPs foi validada por análises químicas. A análise filogenômica apontou para uma ampla distribuição geográfica de B. velezensis, embora linhagens formadas apenas por estirpes do Brasil tenham sido identificadas. A análise filogenética do gene biossintético ituB mostrou que a maioria das estirpes, incluindo B157, UCBB48 e outras já descritas como agentes de controle biológico, possuem o genótipo de produção de iturina A em seu metabolismo secundário. Os resultados obtidos nesta tese servem como prova de conceito para a utilização de concentrados de LPs no controle de doenças foliares e podem representar uma nova abordagem para o controle biológico de doenças de plantas. Palavras-chave: Bioatividade. Doenças foliares. Iturinas, Fengicinas. Metabólitos secundários

Bacteria of the genus Bacillus, particularly those in the group Bacillus subtilis, are widely used in the biocontrol of foliar diseases. The control efficacy is attributed to the antimicrobial activity of lipopeptides (LPs), major secondary metabolites produced by these bacteria. LPs are bioactive molecules of an amphiphilic nature and are divided into three main families: iturins, fengycins and surfactins. Efficient biocontrol strains commonly co-produce the three families of LPs in a diverse metabolic profile. These compounds are naturally produced during bacterial cultivation and are present in the formulation of biofungicides based on Bacillus spp. The aim of this study was to increase the yield of LPs, carry out their chemical and biosynthetic characterization, and evaluate the effectiveness of products enriched with LPs from two strains of Bacillus velezensis, B157 and UCBB48, in the inhibition of phytopathogenic fungi and in the control of foliar diseases. In the first study, the organic extract enriched with LPs of strain B157 was used effectively to control tomato early blight, under controlled conditions. Twenty- seven lipopeptides from the biosynthetic families of surfactins, iturins and fengycins were detected in the chemical profile of B157, with antifungal activity associated with the presence of the last two families of LPs. In a second study, the UCBB48 strain, which has a similar metabolite profile to B157, was used in cultivation optimization experiments to increase LP concentrate yield. The liquid medium selected, based on soybean meal, provided average yields of 1 g/L of precipitate. Attempts to scale up production in a 10 L fermenter resulted in yields smaller than 1 g/L. The antifungal activity of the concentrated product of UCBB48 LPs has been proven in in vitro trials against three soybean foliar pathogens, Colletotrichum truncatum, Corynespora cassiicola and Phakopsora pachyrhizi. Finally, the genomes of strains B157 and UCBB48 were sequenced and compared with genomes of other Brazilian strains and from other geographic regions. Eight clusters of genes associated with the biosynthesis of secondary metabolites were annotated in the genome of the two strains, but only the production of LPS was validated by chemical analysis. The phylogenomic analysis pointed to a widespread distribution of B. velezensis, although lineages formed only by strains from Brazil have been identified. Phylogenetic analysis of the ituB biosynthetic gene showed that most strains, including B157, UCBB48 and others already described as biological control agents, have theiturin A-production genotype in their secondary metabolism. The results obtained in this thesis serve as a proof of concept for the use of LP concentrates in the control of foliar diseases and may represent a new approach for the biological control of plant diseases.

Keywords: Bioactivity. Foliar diseases. Iturins. Fengycins. Secondary metabolites.