Caracterização funcional das proteínas Dicer-like em Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

A importância social, agrícola e econômica do feijoeiro-comum demanda a sustentabilidade de alta produtividade da cultura. A antracnose do feijoeiro-comum, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum é responsável por perdas expressivas na produção de feijão. Esse fungo é conhecido por possuir alta variabilidade genética, refletida no grande número de raças fisiológicas, o que dificulta a manutenção de cultivares resistentes a longo prazo. Fungos fitopatogênicos secretam moléculas efetoras para inativar ou escapar aos mecanismos de defesa da planta hospedeira e pequenos RNAs (sRNAs) podem atuar como efetores. A síntese da maior parte desses sRNAs descritos em fungos exige a participação de proteínas Dicer-like (DCLs), que fazem parte do mecanismo de RNA de interferência (RNAi). Colletotrichum lindemuthianum possui um sistema de silenciamento gênico mediado por RNAi e foi observada a presença de dois genes (dcl1 e dcl2) que codificam proteínas Dicer-like (DCL1 e DCL2). Para avaliar o papel dessas proteínas no desenvolvimento e na patogenicidade de C. lindemuthianum, os genes dcl1 e dcl2 foram deletados utilizando a técnica Split Marker, sendo os mutantes simples analisados e comparados ao isolado tipo selvagem quanto ao crescimento vegetativo, conidiação, formação de tubos de anastomose de conídios (CATs), formação de tubos germinativos (TG) e patogenicidade. Foram obtidos 39 transformantes para dcl1 e 52 transformantes para dcl2, os quais foram analisados por Southern blot. Nos mutantes simples selecionados com perda de função de dcl1 (Δdcl1) ou de dcl2 (Δdcl2), não foram observadas alterações significativas no crescimento, na produção e germinação de conídios ou na agressividade de C. lindemuthianum. Por outro lado, foi observada diminuição na formação de CATs, tanto em Δdcl1 quanto em Δdcl2. Com a obtenção do mutante duplo Δdcl1Δdcl2, foram feitos testes preliminares que demonstram redução dos sintomas da antracnose nas folhas de feijoeiro-comum, bem como na formação de conídios. Assim, sugere-se que esses genes possuam redundância funcional e que pequenos RNAs que tiveram sua formação diminuída devido à falta das proteínas DCLs, que são capazes de processá-los, podem atuar como moléculas efetoras em C. lindemuthianum, contribuindo para a sua patogenicidade. Palavras-chave: Colletotrichum lindemuthianum. Dicer-like. sRNAs. RNAi.

The social, agricultural and economic importance of the common bean demands the sustainability of high productivity of the crop. Common bean anthracnose, caused by the fungus Colletotrichum lindemuthianum, is responsible for significant losses in bean production. This fungus is known to have high genetic variability, reflected in the large number of physiological races, which makes it difficult to maintain long-term resistant cultivars. Phytopathogenic fungi secrete effector molecules to inactivate or evade host plant defense mechanisms and small RNAs (sRNAs) can act as effectors. The synthesis of most of these sRNAs described in fungi requires the participation of Dicer- like proteins (DCLs), which are part of the RNA interference mechanism (RNAi). Colletotrichum lindemuthianum has an RNAi-mediated gene silencing system and the presence of two genes (dcl1 and dcl2) that encode Dicer-like proteins (DCL1 and DCL2) was observed. To evaluate the role of these proteins in the development and pathogenicity of C. lindemuthianum, the dcl1 and dcl2 genes were deleted using the Split Marker technique, and the simple mutants were analyzed and compared to the wild-type isolate in terms of vegetative growth, conidiation, tube formation of conidial anastomosis (CATs), germ tube formation (TG) and pathogenicity. 39 transformants were obtained for dcl1 and 52 transformants for dcl2, which were analyzed by Southern blot. In single mutants selected with dcl1 (Δdcl1) or dcl2 (Δdcl2) loss of function, no significant alterations were observed in the growth, production and germination of conidia or in the aggressiveness of C. lindemuthianum. On the other hand, a decrease in the formation of CATs was observed, both in Δdcl1 and in Δdcl2. By obtaining the double mutant Δdcl1Δdcl2, preliminary tests were carried out that demonstrate a reduction in the symptoms of anthracnose in common bean leaves, as well as in the formation of conidia. Thus, it is suggested that these genes have functional redundancy and that small RNAs that had their formation reduced due to the lack of DCLs proteins, which are capable of processing them, may act as effector molecules in C. lindemuthianum, contributing to its pathogenicity. Keywords: Colletotrichum lindemuthianum. Dicer-like. sRNAs. RNAi.