Transcriptome analysis of prenatal development in pigs

Abstract

The conceptuses (embryos and fetuses) developmental trajectory is characterized as a highly regulated biological event at the transcriptional level, which may be influenced by sexual dimorphism and maternal nutrition. Sexual dimorphism at early developmental period, in which the phenotypic sex differentiation is not evident, is mainly related to the expression of genes linked to sex chromosomes. Maternal nutrition is the main extrinsic factor that affects developmental programming, since the molecules from dietary metabolism affects the intrauterine environment, which are important not only to provide nutrients to the conceptuses growth, but also for transcriptional regulation of genes related to placental and conceptuses development. In this context, the effects of pregnant females’ supplementation with functional amino acids, such as arginine, have been well studied under productive and reproductive aspects in pig production. However, the influence of this supplementation on global gene expression during conceptuses development is still poorly understood. The proper development and functionality of organs and tissues are events determined during embryogenesis and the fetal period, which require an adjusted control of gene expression. Although in species affected by intrauterine growth restriction, such as pigs, the knowledge about genes expression related to organogenesis can help to understand various aspects associated with prenatal development, studies addressing this event are still scarce. Currently, the gene expression, as well as the biological processes and pathways involved in its regulation, has been performed by transcriptome analysis from RNA sequencing (RNA-Seq) and functional analyses. Thus, in the present study, from the RNA-seq of pig embryos at 25 days of gestation and fetuses at 35 days of gestation, we aimed (1) the conceptuses sex determination; (2) to elucidate the effects of pregnant gilts supplemented with L-arginine on the conceptuses transcriptome; and, (3) to reveal the main molecular mechanisms involved in pig organogenesis, through the identification of genes differentially expressed between embryos and fetuses. The results of this thesis showed that Y chromosome-linked genes (DDX3Y, KDM5D, ZFY, EIF2S3Y, EIF1AY, LOC110255320, LOC110257894, LOC396706, LOC100625207 and LOC110255257) presented discrepant reads counts between the embryos and fetuses’ samples, which were used for conceptuses sex determination at early prenatal development. Dietary 1.0% L-arginine supplementation of pregnant gilts resulted in downregulation of mitochondrial genes (ND1, ND2, CYTB, COX2, ATP8, and mt-rRNA type) and upregulation of the CYP1A1 gene in embryos, showing an adjusted transcriptional control at the metabolic level, while the transcriptional program during fetal development was not affected. During the pig organogenesis, 1,705 genes were differentially expressed between embryos and fetuses, from which several biological pathways and processes related to renal, skeletal and bone muscular organogenesis, as well as the development of the cardiovascular and neuronal systems were evidenced. This thesis provided relevant information about the pig prenatal development, which can be applied in studies related to pig production efficiency, as well as greater understanding of developmental biology. Keywords: Conceptuses. Functional amino acids. Organogenesis. Pigs. Prenatal development. RNA-seq.

A trajetória do desenvolvimento dos conceptos (embriões e fetos) é caracterizada como um evento biológico altamente regulado a nível transcricional, podendo ser influenciada pelo dimorfismo sexual e nutrição materna. O dimorfismo sexual no início do desenvolvimento pré-natal, período no qual a diferenciação sexual com base no fenótipo é dificultada, está principalmente associado à expressão de genes ligados aos cromossomos sexuais. A nutrição materna é o principal fator extrínseco que afeta a programação do desenvolvimento, dada a influência que as moléculas resultantes do metabolismo dietético exercem sobre o ambiente intrauterino, as quais são importantes não apenas por proporcionar nutrientes para o crescimento dos conceptos, mas também por regular a transcrição de genes relacionados ao desenvolvimento da placenta e dos conceptos. Neste contexto, os efeitos da suplementação de fêmeas suínas gestantes com aminoácidos funcionais como a arginina sob aspectos produtivos e reprodutivos têm sido bem estudados. Entretanto, a influência dessa suplementação sobre a expressão gênica global durante o desenvolvimento dos conceptos ainda é pouco conhecida. O adequado desenvolvimento e funcionalidade de órgãos e tecidos são eventos determinados principalmente durante a embriogênese e o período fetal, e requerem um ajustado controle da expressão gênica. Embora em espécies acometidas por restrição do crescimento intrauterino, como os suínos, o conhecimento da expressão de genes relacionados a organogênese possa auxiliar no melhor entendimento de vários aspectos da biologia do desenvolvimento pré- natal este ainda tem sido pouco explorado. Atualmente, o conhecimento da expressão gênica bem como dos processos biológicos e vias envolvidas na regulação gênica tem sido possibilitada pela análise do transcriptoma por meio do sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e análises funcionais. Dessa forma, no presente trabalho, a partir do RNA-seq de embriões aos 25 dias de gestação e fetos suínos aos 35 dias de gestação, nós objetivamos (1) determinar o sexo desses conceptos em estágios iniciais do desenvolvimento; (2) elucidar os efeitos da suplementação de marrãs gestantes com L-arginina sobre o transcriptoma dos conceptos; e, (3) evidenciar os principais mecanismos moleculares envolvidos na organogênese em suínos, por meio da identificação de genes diferencialmente expressos entre embriões e fetos. Os resultados desta tese mostraram que os genes ligados ao cromossomo Y (DDX3Y, KDM5D, ZFY, EIF2S3Y, EIF1AY, LOC110255320, LOC110257894, LOC396706, LOC100625207 e LOC110255257) apresentaram contagens discrepantes entre as amostras de embriões e fetos suínos as quais foram utilizadas para a determinação do sexo dos conceptos. A suplementação dietética de marrãs com 1% de L-arginina provocou redução na expressão de genes mitocondriais (ND1, ND2, CYTB, COX2, ATP8, e mt-rRNA type) e aumento na expressão do gene CYP1A1 em embriões, evidenciando um ajustado controle transcricional a nível metabólico, enquanto não provocou alterações transcricionais durante o desenvolvimento fetal. Durante a organogênese em suínos, 1705 genes foram diferencialmente expressos entre embriões e fetos, a partir dos quais várias vias e processos biológicos relacionados à organogênese renal, muscular esquelética e óssea, bem como o desenvolvimento dos sistemas cardiovascular e neuronal, foram evidenciados. Esta tese proporcionou relevantes informações sobre o desenvolvimento pré-natal de suínos que podem ser aplicados em estudos relacionados à eficiência na produção de suínos, bem como no maior entendimento da biologia do desenvolvimento. Palavras-chave: Aminoácidos funcionais. Conceptos. Desenvolvimento pré-natal. Organogênese. RNA-seq. Suínos.