Avaliação de protocolos enumeração de bactérias láticas e estafilococos em queijo Minas artesanal do Serro

Abstract

Queijo Minas artesanal (QMA) do Serro podem ser produzidos com “pingo” ou “rala”, apresentando uma microbiota complexa composta de bactérias láticas (BAL) e outros micro-organismos. Para a enumeração de BAL são necessários meios de cultura ricos em nutrientes e com agentes seletivos. Entretanto, as metodologias convencionais possuem limitações quanto a seletividade e praticidade. Assim, as placas 3M™ Petrifilm™ Lactic Acid Bacteria (LAB) foram desenvolvidas como um método alternativo para enumeração do BAL. Esse estudo teve como objetivo avaliar a performance das placas Petrifilm™ LAB para enumeração de BAL em QMA do Serro. Na primeira etapa, 6 amostras de QMA do Serro (3 “pingo”, 3 “rala”) foram plaqueadas em PCA e incubadas a 37 °C por 48h. As amostras apresentaram uma contagem média de 7,4 log UFC/g, e não foi constatada diferença significativa entre os tipos de queijo (p > 0,05). Posteriormente, 140 colônias foram selecionadas aleatoriamente das placas de PCA, identificadas bioquimicamente e por análises moleculares (16S rRNA): 71% dos isolados obtidos foram identificados como BAL, Staphylococcus, Acinetobacter, Exiguobacterium e Aerococcus também foram identificados. Para a análise do comportamento da microbiota em meios de cultura seletivos, os 140 isolados foram diluídos e submetidos a sete protocolos distintos para enumeração de BAL e Staphylococcus: 1) MRS pH 5,7 30 °C/ 72 h e 2) protocolo 1 em anaerobiose; 3) MRS pH 5,7 37 °C/ 48 h; 4) M17 37 °C/ 48 h; 5) Petrifilm™ LAB 37 °C/ 48 h; 6) Petrifilm™ STX 37 °C/ 24 h e, 7) Baird-Parker 37 °C/ 48 h. Para BAL, a maioria dos isolados desse grupo apresentou morfologias típicas no Petrifilm™ LAB (92%) e M17 (93%). A presença de colônias de Staphylococcus, Acinetobacter e Exiguobacterium com morfologias típicas foram observadas no Petrifilm™ LAB. As contagens obtidas em Petrifilm™ LAB e M17 foram estatisticamente superiores às demais (p < 0,05). Poucos isolados de Staphylococcus formaram colônias típicas nos protocolos Petrifilm STX (29,4%) e Baird-Parker (21,7%), entretanto, Lb. plantarum, L. lactis e Acinetobacter apresentaram morfologias típicas no Petrifilm™ STX. Não houve diferença significativa entre os protocolos analisados para enumeração de Staphylococcus. Na segunda etapa, 55 amostras de QMA do Serro foram selecionadas (7 “pingo”; 48 “rala”) e submetidas a enumeração de BAL pelos protocolos 1, 2, 3, 4 e 5, sendo que o último foi analisado nos tempos 24, 48 e 72 h. Análise de variância dos resultados obtidos indicou ausência de diferenças significativas independente dos protocolos, tempos de incubação e tipos de queijo. Entretanto, foi observado um baixo índice de correlação entre os protocolos convencionais e Petrifilm™ LAB. Colônias foram selecionadas aleatoriamente de cada amostra de queijo e de cada protocolo para coloração de Gram e teste de catalase, para caracterização de BAL. Petrifilm™ LAB foi o protocolo que mais selecionou BAL (82,9%), diferindo estatisticamente dos demais. Isolados obtidos dos protocolos MRS1 e Petrifilm foram submetidos a identificação molecular e verificou-se uma seletividade compatível com a composição esperada em queijos artesanais. Esses resultados confirmam a aplicabilidade do Petrifilm™ LAB para enumeração de BAL em QMA do Serro. Palavras-chave: Bactérias Láticas. Enumeração. Petrifilm. Queijos Artesanais.

Minas artisanal cheese produced in Serro (SAC) can be produced with "pingo" or "rala", presenting a complex microbiota consisting of lactic acid bacteria (LAB) and other microorganisms. Enumeration of LAB requires nutrient rich culture media and selective agents. However, the conventional methodologies used to enumerate these microorganisms have limitations regarding selectivity and practicality. Thus, 3M ™ Petrifilm ™ Lact Bactia Bacteria (LAB) plates were developed as an alternative method of enumeration of LAB. This study aimed to evaluate the performance of the Petrifilm™ LAB plates for LAB enumeration in SAC. In the first stage, 6 SAC samples (3 “pingo”; 3 “rala”) were plated in PCA and incubated at 37 °C for 48h. The samples presented mean count of 7.4 log CFU/g and no significant differences was found between the types of cheese (p > 0.05). Then, 140 colonies were randomly selected from PCA plaques, identified biochemically and by molecular analysis (16S rRNA): 71% of the isolates obtained were identified as BAL. Staphylococcus, Acinetobacter, Exiguobacterium and Aerococcus were also identified. For the analysis of the microbiota behavior in selective culture media, the 140 isolates were diluted and subjected to seven different protocols for LAB and Staphylococcus enumeration: 1) MRS pH 5.7 30 °C/ 72 h; 2) protocol 1 in anaerobiosis; 3) MRS pH 5.7 37 °C/ 48 h; 4) M17 37 °C/ 48 h; 5) Petrifilm™ LAB, 37 °C/ 48 h; 6) Petrifilm™ STX 37 °C/ 24 h and 7) Baird-Parker 37 °C/ 48 h. Regarding LAB, most of isolates presented the typical morphology in Petrifilm™ LAB (92%) and M17 (93%), but non-LAB isolates presented also typical morphology (Staphylococcus, Acinetobacter and Exiguobacterium) in Petrifilm™ LAB. With regard to LAB, counts obtained by Petrifilm LAB and M17 were significantly higher when compared to other protocols (p < 0.05). For Staphylococcus, only some isolates identified as Staphylococcus formed typical colonies in the Petrifilm™ STX (29.4%) and Baird-Parker (21.7%) and some isolates in Lb. plantarum, L. lactis and Acinetobacter presented typical morphology in Petrifilm™ STX. There was no significant difference between the protocols analyzed for Staphylococcus. In the second stage of the study, 55 SAC samples (7 “pingo”; 48 “rala”) and submitted to BAL enumeration by protocols 1, 2, 3, 4 and 5, the last one being analyzed at times 24, 48 and 72 h. Analysis of variance of counts obtained by the tested protocols indicated no significant differences, regardless of incubation times and cheese types. However, low correlation indexes were observed between conventional protocols and Petrifilm™ LAB (r < 0.6). Colonies were randomly selected (n = 2,569) from cheeses sample and protocols for Gram staining and catalase test, for LAB characterization (n = 1,901). Petrifilm™ LAB allowed higher confirmation of LAB colonies (82.9%) when compared to other protocols. Isolates obtained from MRS1 and Petrifilm™ LAB protocols were also subjected to molecular identification and verified a selectivity compatible with the expected composition of the artisanal cheese microbiota. These results confirm the applicability of Petrifilm™ LAB for LAB enumeration in SAC. Keywords: Lactic Acid Bacteria. Enumeration. Petrifilm. Artisan Cheese.