NTPDase2 de Leishmania (Viannia) braziliensis: expressão heteróloga, caracterização bioquímica e análise de inibidores derivados da quercetina

Abstract

Leishmania (Viannia) braziliensis é o principal causador da Leishmaniose Tegumentar Americana. Os tratamentos não são sempre efetivos e apresentam efeitos adversos, sendo necessário o desenvolvimento de novas terapias. Correlação entre atividade ectonucleotidásica e virulência, em diferentes espécies de Leishmania, apontam para a importância das NTPDases como fatores de virulência do parasito. Neste trabalho, estudamos as variantes para rLbNTPDase2 dos isolados ET e NSL de L. (V.) braziliensis, com o objetivo de avaliar se diferenças bioquímicas podem estar relacionadas a diferenças na virulência desses isolados e avaliamos o potencial de inibição da rET-NTPDase2 por compostos derivados da quercetina. A sequência do ectodomínio (S43-E425) foi expressa em sistema bacteriano e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a níquel. Nossos resultados mostram que as enzimas possuem 5 regiões conservadas de apirase (ACRs). As 4 mutações de rNSL-NTPDase-2 estão fora das ACRs e a mutação Q99P se localiza dentro do domínio B (R82-Y121), região antigênica conservada. Após expressão e purificação, foram identificadas bandas preditas de 45 KDa. Os resultados de atividade enzimática mostram que ambas são genuínas ENTPDases, pois hidrolisam nucleotídeos tri e difosfatados, mas não AMP. O perfil geral de hidrólise foi UDP>GDP>ADP>ATP=UTP para rET-NTPDase2 e GDP=UDP>ADP=ATP=UTP para rNSL-NTPDase2, sendo ambas difosfatases. rNSL- NTPDase2 apresenta maior taxa de hidrólise NTP:NDP, sugerindo que as mutações possam direcionar uma maior hidrólise de nucleotídeos trifosfatados. Adicionalmente, rNSL- NTPDase2 apresenta maior hidrólise de ATP, o que pode explicar, pelo menos parcialmente, sua maior virulência. Continuamos os ensaios de caracterização com a enzima rET-NTPDase2 e avaliamos o potencial de inibição de compostos derivados da quercetina. Nossos resultados mostram que a enzima foi inibida por suramina e DIDS, inibidores de outras ENTPDases. Altos valores de K m para ATP, ADP e UDP sugerem improvável atuação na desativação de receptores purinérgicos. Contudo, sugerimos que a enzima tenha importância em situações específicas de alta concentração de nucleotídeos ou no ambiente intracelular. Dois compostos, IL-09 e IL-05, inibiram a atividade enzimática em 92,88% e 88,41% com excesso de substrato. Baixo valor de IC 50 para o IL-09 (6.56 µM), indica uma alta afinidade do composto com a enzima, ideia reforçada pela cinética enzimática na presença de IL-09, que indica um perfil de inibição do tipo misto. Sua composição química sugere que a presença de benzilas nos grupamentos fenólicos possa ser determinante para a alta afinidade de interação do composto. Esperamos que este estudo possa contribuir para o entendimento das NTPDases em L. braziliensis e auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos para tratamento da leishmaniose tegumentar. Palavras-chave: Leishmania braziliensis. Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase-2. Bioquímica. Quercetina.

Leishmania (Viannia) braziliensis is a pathogenic protozoan causative of American Tegumentary Leishmaniasis. Treatments are not always effective and present adverse effects, requiring the development of new therapies. Correlation between ectonucleotidase activity and virulence in different species of Leishmania, point to NTPDases as important virulence factors of parasite. In this work, we study the rLbNTPDase2 variants of ET and NSL strains from L. (V.) braziliensis in order to evaluate if biochemical differences could be related to differences in virulence and evaluated the inhibition potential of rET-NTPDase2 by quercetin derivative compounds. The ectodomain sequence (S43-E425) was expressed in bacterial system and the recombinant proteins were purified by nickel affinity chromatography. Our results show that the enzymes have 5 apyrase conserved regions (ACRs). The 4 mutations of rNSL-NTPDase-2 are outside of ACRs and the Q99P mutation are located inside Domain B (R82-Y121), a conserved antigenic region. After expression and purification, predict bands of 45 KDa were identified. Enzymatic activity show that both enzymes are genuine ENTPDases, since they hydrolyze tri and diphsphates nucleotides, but not AMP. The overall hydrolysis was UDP>GDP>ADP>ATP=UTP for rET-NTPDase2 and GDP=UDP>ADP=ATP=UTP for rNSL-NTPDase2, both being diphosphatases. rNSL-NTPDase2 present a higher rate NTP:NDP, suggesting that the mutations could direct a higher hydrolysis of triphosphate nucleotides. Additionally, rNSL-NTPDase2 variant present a higher ATP hydrolysis, which could explain, at least partially, its higher virulence. We continue the charatcterization tests with rET-NTPDase2 and evaluated the inhibition potential of quercetin derivative compounds. Our results show that the enzyme was inhibited by suramin and DIDS, inhibitors of others NTPDases. High K m values for ATP, ADP e UDP suggests unlikely role in the deactivation of purinergic receptors. However, we suggest relevant role in specific situations of high nucleotide concentration and in intracellular environment. Two compounds, IL-09 e IL-05, inhibited enzymatic activity by 92,88% and 88,41% using excess of substrate. Low IC 50 value for IL-09 (6.56 µM), indicates a high affinity of the compound, idea reinforced by the kinetic data in the presence of IL-09 compound, which indicates a mixed-type inhibition profile. Its chemical composition suggests that the benzil on the phenolic groups can be determinant for the high affinity interaction of the compound. We hope that this study can contribute to understanding of NTPDases in L. braziliensis and help in the development of new drugs for the treatment of cutaneous leishmaniasis. Keywords: Leishmania braziliensis. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2. Biochemistry. Quercetin.