Participação da via de sinalização mediada pela proteína DCD/NRP na morte celular em soja induzida por cádmio e infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhizi

Abstract

Mudanças ambientais e condições extremas, como variações de temperatura, seca e salinidade, além de estresses bióticos, afetam adversamente o crescimento das plantas e causam grande perda de produtividade para as culturas agrícolas em todo o mundo. Entretanto, as plantas desenvolveram várias estratégias para tolerar esses fatores como mecanismos sofisticados de percepção de estresses, sinalização e respostas de defesa. A via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRPs (Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins) tem sido caracterizada em resposta a estresses abióticos, durante senescência foliar natural e em interações incompatíveis. Estes processos biológicos resultam em morte celular programada. O objetivo dessa pesquisa foi verificar a atuação da via de sinalização mediada por DCD/NRPs em resposta ao cádmio (Cd 2+ ), que promove morte celular, e estresse biótico causado pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. No capítulo I, foi demonstrado que Cd 2+ limita o crescimento da planta, causa intensa vermelhidão na nervura da folha, amarelecimento da folha e clorose na soja (Glycine max). Esses sintomas foram associados à morte celular programada (PCD) induzida por Cd 2+ , dado que folhas de soja estressadas por Cd 2+ exibiram número reduzido de núcleos, morte celular, dano ao DNA e atividade da caspase-1 aumentados em comparação com folhas não estressadas. Consistente com estas observações, Cd 2+ causou indução dos genes NRPs, GmNAC81, GmNAC30 e VPE, que são os componentes da sinalização de morte celular mediados por DCD/NRP, que executam PCD via atividade de caspase-1 de VPE (Vacuolar Processing Enzyme). Além disso, a superexpressão do regulador positivo desta sinalização de morte celular, GmNAC81, aumentou a sensibilidade ao estresse de Cd 2+ e intensificou as marcas de PCD mediada por Cd 2+ . A superexpressão de GmNAC81 aumentou a produção de H 2 O 2 induzida por Cd 2+ , morte celular, dano ao DNA e expressão de VPE. Por outro lado, a superexpressão de BiP, um regulador negativo do módulo de sinalização NRPs/GmNACs/VPE, conferiu tolerância ao estresse de Cd 2+ e redução da morte celular mediada por Cd 2+ . O segundo capítulo focalizou na interação entre o fungo biotrófico Phakopsora pachyrhizi e soja. Esforços de triagem em germoplasmas de sojas levaram à identificação de várias fontes de resistência a P. pachyrhizi mediada por genes Rpp. Entretanto, a caracterização dos efetores ou outros determinantes que contribuem para o reconhecimento dos isolados de P. pachyrhizi em soja não foi completamente elucidada. Neste estudo, também foi investigado se a via DCD/NRP poderia estar envolvida em interações compatíveis e incompatíveis durante a infecção com P. pachyrhizi em plantas de soja suscetíveis, BR16 e Conquista, e resistentes, BRS511 e TMG7262. Após 72 h da inoculação, a expressão dos componentes da via foi induzida nas linhagens suscetíveis BR16 e conquista e na linhagem resistente TGM7262 embora em extensões diferentes. Significantemente, a expressão dos componentes da via de morte celular em condições normais foi muito superior na linhagem resistente TGM7262, resultando em altíssima expressão de VPE, um componente importante de HR. Estes resultados sugerem que a via DCD/NRP de morte celular é ativada durante a infecção com o fungo. A fim de avaliar o envolvimento de VPE nos mecanismos de resistência, a expressão de VPE foi constitutivamente aumentada na linhagem suscetível BR16 através de superexpressão do gene GmNAC081. A superexpressão constitutiva de GmNAC081 alterou o fenótipo de suscetibilidade, sendo que as plantas transgênicas infectadas apresentaram menor número de urédias abertas e amarelecimento menos intenso das folhas ao longo da infecção, quando comparadas com BR16 não transformada. Estes resultados sugerem que a expressão aumentada de VPE pode retardar o processo de infecção pelo fungo P. pachyrhizi em soja. Entretanto, a superexpressão de um regulador negativo da via DCD/NRP, BiP, não inibiu a indução dos componentes da via DCD/NRP durante a infecção. A expressão de VPE em plantas superexpressando GmBiPD foi induzida em todos os tempos analisados após a inoculação e as plantas apresentam maior severidade de infecção, com maior número de urédias abertas e um amarelecimento acentuado do tecido. Sendo a via de sinalização de morte celular mediada por DCD/NRP induzida pelos hormônios ácido abscísico (ABA) e ácido salicílico (AS), foi também investigado o acúmulo desses hormônios em plantas infectadas. Observou-se que plantas superexpressando BiP acumularam um nível superior dos hormônios ABA e AS do que as plantas controle conquista. Provavelmente, o acúmulo acentuado de ABA e AS nas linhagens transgênicas superaram o efeito negativo de BiP na indução da via DCD/NRP. Coletivamente, estes resultados sugerem que a via de morte celular mediada por DCD/NRPs integra uma resposta coordenada a diversos sinais de estresses, portanto, sua manipulação possui o potencial para melhorar a tolerância da cultura a estresses bióticos e abióticos. Palavras-chave: Sinalização celular. Proteínas ricas em asparagina. Cd. Fungo. Morte celular. Morte celular mediada por NRP. Soja. Proteína de ligação. BiP. Enzima de processamento vacuolar. VPE.

Environmental changes and extreme conditions, including variations in temperature, drought, and salinity, in addition to biotic stresses, adversely affect plant growth and cause great yield loss for agricultural crops worldwide. However, plants have developed several strategies to tolerate these factors as sophisticated mechanisms for perceiving stresses, signaling, and defense responses. The cell death signaling pathway mediated by DCD/NRPs (Development and Cell Death domain-containing N-Rich Proteins) has been characterized in response to abiotic stresses, during natural leaf senescence and in incompatible interactions. These biological processes result in programmed cell death. This investigation aimed to examine the role of the DCD/NRPs-mediated signaling pathway in response to cadmium (Cd 2+ ), that promotes cell death, and biotic stress caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi. In chapter I, we showed that Cd 2+ limits the growth of the plant, causes intense redness in the leaf vein, leaf yellowing, and chlorosis in soybeans (Glycine max). These symptoms were associated with Cd 2+ -induced programmed cell death (PCD), since Cd 2+ stressed soybeans exhibited a reduced number of nuclei, increased cell death, DNA damage, and caspase-1 activity compared to non-stressed leaves. Accordingly, Cd 2+ induced NRPs, GmNAC81, GmNAC30, and VPE, the DCD/NRP-mediated cell death signaling components, which executes PCD via caspase 1-like VPE activity. Furthermore, overexpression of the positive regulator of this cell death signaling, GmNAC81, increased the sensitivity to Cd 2+ stress and intensified the Cd 2+ mediated PCD hallmark. Overexpression of GmNAC81 increased the production of H 2 O 2 induced by Cd 2+ , cell death, DNA damage and VPE expression. Conversely, the overexpression of BiP, a negative regulator of the NRPs/GmNACs/VPE signaling module, conferred tolerance to Cd 2+ stress and reduced Cd 2+ mediated cell death. Collectively, the results of chapter I indicate that Cd 2+ induces PCD in plants via activation of the NRP/GmNAC/VPE regulatory circuit that links developmentally and stress-induced cell death. The second chapter focused on the interaction between the biotrophic fungus Phakopsora pachyrhizi and soybean. Screening efforts of soybean germplasms have led to the identification of several sources of Rpp genes-mediated resistance to P. pachyrhizi. However, the characterization of effectors or other determinants that contribute to the recognition of P. pachyrhizi isolates in soybean has not been completely elucidated. In this study, we investigated whether the DCD/NRP pathway could be involved in compatible and incompatible interactions during infection with P. pachyrhizi in susceptible soybean plants, BR16 and Conquista, and resistant plants, BRS511 and TMG7262. At 72 hours after inoculation, the expression of the pathway components was induced in the susceptible strains BR16 and Conquista and in the resistant strain TGM7262 although to different extents. Significantly, the expression of the components of the cell death pathway under normal conditions was much higher in the resistant strain TGM7262, resulting in extremely high expression of VPE, an important component of HR. These results suggested that the cell death DCD/NRP pathway is activated during infection with the fungus. In order to evaluate the involvement of VPE in the resistance mechanisms, the expression of VPE was constitutively increased in the susceptible strain BR16 by overexpressing GmNAC081. Overexpression of GmNAC081 altered the susceptibility phenotype, and the infected transgenic plants had fewer open uredinia and attenuated leaf yellowing during infection when compared to untransformed BR16. These results suggest that the increased expression of VPE may delay the infection process by the fungus P. pachyrhizi in soybeans. However, the overexpression of a negative regulator of the DCD/NRP pathway, BiP, did not inhibit the induction of components of the DCD/NRP pathway during infection. The expression of VPE in plants overexpressing GmBiPD was induced at all times analyzed after inoculation and the plants displayed higher severity of infection, with a greater number of open uredinia and a pronounced leaf yellowing. Since the DCD/NRP-mediated cell death signaling pathway is induced by the hormones abscisic acid (ABA) and salicylic acid (SA), the accumulation of these hormones in infected plants was also investigated. BiP-overexpressing plants accumulated higher levels of the hormones ABA and SA than control plants. Probably, the accentuated accumulation of ABA and SA in the transgenic strains overcame the negative effect of BiP on the fungus-mediated induction of the DCD/NRP pathway. Collectively, these results suggest that the cell death pathway mediated by DCD/NRPs integrates a coordinated response to various stress signals and, therefore, may be regarded as a potential genetic engineering target to improve crop tolerance to biotic and abiotic stresses. Keywords: Cell signaling. Asparagine-rich proteins. Cd. Fungus. Cell death. NRP-mediated cell death. Soy. Binding protein. BiP. Vacuolar processing enzyme. VPE.