Comunicação cruzada entre imunidade antiviral, antibacteriana e eventos de desenvolvimento mediados pelos receptores NIK1, NIK2 e NIK3

Abstract

As proteínas NIKs (NSP- INTERACTING KINASE), são LRR-LRKs (leucine-rich repeat receptor-like kinase) que se localizam na membrana plasmática e foram identificadas inicialmente por interagirem com a proteína NSP (NUCLEAR SHUTTLE PROTEIN) de geminivírus. NIK1 pertence à subfamília II de LRR-RLKs, cujos membros contém cinco repetições de leucina no domínio extracelular, e forma um sub-grupo contendo NIK1, NIK2 e NIK3. NIK1 e NIK2 divergem quanto a funcionalidade e estrutura de NIK3, sendo NIK1 a mais bem caracterizada, atuando na imunidade antiviral. Recentemente, foi demonstrado por meio de análises cêntricas da rede de interações entre receptores LRR de membranas que NIK1 e NIK3 formam “hubs” com alto grau de centralidade e, portanto, presume-se que sejam altamente influentes como transmissores de informação nas células. Estas observações levantaram as hipóteses de que NIK1 e NIK3 pudessem estar envolvidos em diversas vias de sinalização celular. Assim sendo, o objetivo dessa investigação foi caracterizar o envolvimento de NIK1, NIK2 e NIK3 em vias de sinalização de defesa e desenvolvimento. Nós relatamos primeiro que NIK1, anteriormente mostrado como um regulador positivo da imunidade antiviral de plantas, atua como um regulador negativo da imunidade antibacteriana. NIK2 também demonstrou funcionar como um supressor de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). Embora a inativação de NIK2 não tenha afetado à infecção por Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst) DC3000 e P. Syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, o mutante nik2-1 mostrou ser mais suscetível ao crescimento de Pst DC3000 hrcC, o mutante de secreção não patogênico Pst DC3000 tipo III, demonstrando a modulação negativa de PTI por NIK2. A modulação negativa de PTI mediada por NIK1 foi mais forte do que NIK2. As plantas que são nik1 nulo exibiram morfologia anã, maior resistência a doenças causadas pela bactéria Pseudomonas Syringae e respostas PTI aumentadas por flagelina bacteriana, que foram restaurados pela reintrodução de NIK1. De forma consistente, as linhagens de superexpressão de NIK1 exibiram um fenótipo oposto. Além disso, NIK1 regulou negativamente a formação do complexo FLS2 / BAK1 e respostas mediadas por flg22. As interações entre NIK1 e o receptor de flagelina FLS2 e o co-receptor BAK1 foram aumentadas após a percepção de flg22, revelando um novomecanismo regulador de PTI por um RLK. Além disso, a percepção de flg22 induziu a fosforilação de NIK1 e RLP10A in vivo e, por sua vez, ativou o ramo de controle de tradução a jusante da sinalização antiviral. O mecanismo subjacente proposto para a modulação inversa mediada por NIK1 da imunidade antiviral e antibacteriana pode permitir que bactérias e vírus ativem respostas imunes do hospedeiro uns contra os outros. Em relação ao NIK3, propusemos pesquisar seu envolvimento na defesa e no desenvolvimento examinando primeiro o transcriptoma induzido por NIK3. Também examinamos o efeito do tratamento com brassinosteróides na variação global da expressão gênica em linhas de superexpressão de NIK3. Os resultados dessas análises genômica funcional confirmaram que NIK3 pode estar envolvido na defesa e no desenvolvimento. NIK3 pode estar envolvido na sinalização de citocinina (CK) em vez da sinalização de BR. Em comparação com Col-0, BR induziu respostas semelhantes em linhagens de superexpressão de NIK3. No entanto, a superexpressão de NIK3 regulou negativamente nove genes envolvidos na percepção e homeostase de CK, incluindo dois receptores de CK, AHK4 e AHK5, duas proteínas de fosfotransferência de histidina (AHPs), AHP1 e AHP5, reguladores positivos da sinalização de CK que fosforilam as ARRs do tipo B (Regulador de resposta de Arabidopsis). ARR4 e ARR8 retransmitem o sinal de CK do citoplasma para o núcleo para induzir a expressão de genes. Como um regulador negativo da sinalização de CK ARR15, um ARR tipo B, foi induzido por NIK3. Os transportadores de purinas e derivados PUP1, PUP2 e PUP14 foram regulados negativamente por NIK3. O PUP14 é um regulador negativo da detecção de CK, pois transporta a CK do apoplasto para o citosol; assim, impedindo AHKs de detectar CK e iniciar a sinalização. Portanto, a superexpressão de NIK3 revelou a regulação de uma série de genes associados à sinalização de CK. Especificamente, os principais reguladores da percepção e sinalização de CK foram reprimidos pela superexpressão de NIK3, sugerindo que NIK3 pode controlar negativamente a sinalização de CK. A superexpressão do NIK3 também regulou negativamente os genes associados às respostas imunológicas. Estes incluem os PRR-RLKs, FLS2 e EFR, que reconhecem os PAMPs bacterianos fls2 e EF-Tu para iniciar PTI, MAPK e fatores de transcrição WRKYs, envolvidos nas respostas imunes. Da mesma forma, NIK3 regulou negativamente os genes R, RRS1 e RPM1, bem como FRK1, um modulador das respostas imunes. Apesar da regulação negativa dos genes de defesa mediada por NIK3, PTI não foi aparentemente afetado, uma vez que a infecção por Pst DC3000 e o crescimento em linhagens superexpressando NIK3 foram semelhantes a Col-0. Portanto, é razoável supor que NIK3 regule principalmente ETI. Coletivamente, esses resultados sugerem que NIK3 é predominantemente um reguladornegativo da sinalização e desenvolvimento, como na sinalização de CK, e da resposta imune, do tipo ETI. Palavras-chave: Imunidade antiviral. Imunidade antibacteriana. Desenvolvimento. RNA-seq

NIKs [NUCLEAR SHUTTLE PROTEIN (NSP)-INTERACTING KINASES] are plasma membrane-anchored LRR-LRKs (leucine-rich repeat receptor-like kinases), first identified by their capacity of interacting with the geminivírus NSP. NIK1 belongs to the subfamily II of LRR-RLKs, which comprises proteins with five leucine-rich repeats in the extracellular domain and form a sub-clade containing NIK1, NIK2, and NIK3. NIK1 and NIK2 diverge in function and structure from NIK3, and NIK1 is the best-characterized member, acting in antiviral immunity. Recently, centric analyses of the protein-protein interaction network of the cell surface LRR receptors have demonstrated that NIK1 and NIK3 form “hubs” with a high degree of centrality, and hence they may be considered highly influential spreaders of information in the cell. These findings raised the hypothesis that NIK1 and NIK3 would be involved in several distinct cell signaling pathways. In the current investigation, the possible involvement of NIK1, NIK2, and NIK3 in defense and developmental signaling pathways was examined. We report first that NIK1, which was previously shown to positively regulate plant antiviral immunity, acts as an essential negative regulator of antibacterial immunity. NIK2 was also demonstrated to function as a PAMP-triggered immunity (PTI) suppressor. Although inactivation of NIK2 did not affect infection with Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000 and P. syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, the nik2-1 mutant showed more susceptible to the Pst DC3000 hrcC growth, the nonpathogenic Pst DC3000 type III secretion mutant, demonstrating the negative modulation of PTI by NIK2. The NIK1-mediated negative modulation of PTI was stronger than NIK2. Plants that are nik1 null exhibited dwarfed morphology, enhanced disease resistance to the bacteria Pseudomonas syringae, and enhanced bacterial flagellin–triggered PTI responses, which were restored by reintroduction of NIK1. Consistently, NIK1 overexpressing lines displayed an opposite phenotype. In addition, NIK1 negatively regulated the formation of the FLS2/BAK1 complex and flg22-mediated responses. The interactions between NIK1 and the flagellin receptor FLS2 and coreceptor BAK1 were enhanced upon flg22 perception, revealing a novel PTI regulatory mechanism by an RLK. Furthermore, flg22 perception induced NIK1 and RLP10A phosphorylation in vivo and, in turn,activated the downstream translation control branch of antiviral signaling. The proposed underlying mechanism for NIK1-mediated inverse modulation of antiviral and antibacterial immunity may allow bacteria and viruses to activate host immune responses against each other. Concerning NIK3, we proposed to search for its involvement in defense and development by examining first the NIK3 induced transcriptome. We also examined the effect of brassinosteroid treatment on the global variation of gene expression in NIK3-overexpressing lines. The results of these functional genomic analyses confirmed that NIK3 might be involved in both defense and development. NIK3 may be involved in cytokinin (CK) signaling rather than BR signaling. As compared to Col-0, BR induced similar responses in NIK3- overexpressing lines. However, the NIK3 overexpression down-regulated nine genes involved in CK perception and homeostasis, including two CK receptors, AHK4 e AHK5, two histidine phosphotransfer proteins (AHPs), AHP1 and AHP5, positive regulators of CK signaling that phosphorylate the type B ARRs (Arabidopsis response regulator). ARR4 and ARR8 relay the CK signal from the cytoplasm to the nucleus to induce gene expression. As a negative regulator of CK signaling ARR15, a type B ARR, was induced by NIK3. The purine transporters PUP1, PUP2 e PUP14 were down-regulated by NIK3. PUP14 is a negative regulator of CK sensing because it transports CK from the apoplast to the cytosol; thereby, preventing AHKs from sensing CK and initiating signaling. Therefore, the NIK3 overexpression uncovered the regulation of a series of CK signaling-associated genes. Specifically, key regulators of CK perception and signaling were suppressed by NIK3 overexpression, suggesting that NIK3 may negatively control CK signaling. The NIK3 overexpression also down-regulated genes associated with immune responses. These include the PRR-RLKs, FLS2 and EFR, which recognize the bacterial PAMPs fls2 and EF-Tu to initiate PTI, MAPK, and transcriptional factors WRKYs, involved in immune responses. Likewise, NIK3 down-regulated the R genes, RRS1 and RPM1, as well as FRK1, the modulator of immune responses. Despite the NIK3-mediated down-regulation of defense genes, PTI was not apparently affected because Pst DC3000 infection and growth in NIK3-overexpressing lines were similar to Col-0. Therefore, it is reasonable to suppose that NIK3 regulates mainly ETI. Collectively, these results suggest that NIK3 is predominantly a negative regulator of developmental signaling, as in CK signaling, and immune response, as in ETI. Keywords: Antiviral immunity. Antibacterial immunity. Development. RNA-seq